氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

§1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的

掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。

二、实验原理

带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。

转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。

基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而

在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca++处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA

愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。

为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。

三、仪器与试剂

1．隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。

2．待转化质粒DNA。

3．高效感受态DH5a细菌细胞，试剂A，无菌双蒸水。

4．LB液体培养基，LB固体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)。

5．100mmol/L氯化钙溶液(已消毒)。

四、实验步骤

（一）.实验室感受态细胞的制备和转化方法（此过程只作了解）：

1．感受态细胞的制备：

(1)需在超净台内操作，用接种环挑取单克隆大肠杆菌的DH5ɑ

菌落于2ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。

(2)将上述过夜培养的细菌按1：100的比例转接至5ml LB液体培养基中振荡培养2-3小时(OD600约0.2<0.4)。

(3)将上述生长对数期的菌液置冰上10分钟，4℃离心8000rpm, 30秒,弃去上清。

(4)用100mmol/L的氯化钙溶液400ul悬浮菌体，冰浴10分钟，4℃离心，4000rpm，5分钟，弃去上清。

（5）再把菌体悬浮在400ul冰上预冷的100mmol/L氯化钙溶液中，此菌液即为感受态细菌，按100ul分装在已消毒的Eppendorf管内，置4℃冰箱中备转化用。

2．转化：

（1）制冰盒一个，打开净化工作台电源，使其处于工作状态，将水浴锅调至42℃，涂布棒浸泡在75%酒精中，以下操作除孵育、振荡菌液外，其余均需在净化工作台内进行。

（2）从4℃冰箱中取出感受态细菌和从-20℃冰箱中取出质粒DNA的Eppendorf管各一支，置冰盒内。

（3）在净化工作台内，将质粒DNA 1ul加入感受态细菌100ul 取Eppendorf管内，混匀，置冰上30分钟。

（4）然后立即置42℃水浴中90秒，不要摇动试管，取出后置冰盒中冷却2分钟。

（5）向每管中加入900ul LB液体培养基（无氨苄青霉素），在37℃摇床上温和摇动，转速200 rpm，1小时。

（6）取出37℃预热了30分钟的LB琼脂固体培养基（含氨苄青霉素100ug/ml）平皿，点上酒精灯，将消毒浸泡的涂布棒凉干。

（7）将转化的感受态细胞用涂布棒均匀地涂布在LB琼脂固体培养基（含氨苄青霉素）平皿上，做上标记。

（8）铺菌平皿倒置在培养箱中，37℃培养12小时，长出单菌落。

（9）取消毒玻璃试管一支，加3ml LB液体培养基、3ul氨苄青霉素（0.1mg/ul），将培养出的单菌落用消毒牙签或接种棒挑出一个菌落融入试管，置37℃摇床上温和摇动，转速200 rpm，12小时。（二）.基因公司提供的高效感受态DH5a细菌细胞转化方法：1．制冰盒一个，打开净化工作台电源，使其处于工作状态，以下操作除孵育、振荡菌液外，其余均需在净化工作台内进行。

2．从-80℃冰箱中取出“高效感受态DH5a细菌细胞”一支，“试剂A”，从-20℃冰箱中取出无菌双蒸水一支和待转化的质粒DNA 一支，均置冰盒内。

3．取消毒1.5 ml Eppendorf管一支，用移液器将待转化质粒DNA 1ul、“试剂A”20 ul、无菌双蒸水80 ul，分别吸入消毒1.5 ml Eppendorf管内混匀，冰上备用。将高效感受态DH5a细菌细胞80-100 ul吸入消毒1.5 ml Eppendorf管内混匀，冰浴20分钟。随后，室温放置10分钟。

4．在1.5 ml Eppendorf管内加入400ul LB液体培养基，37℃，200rpm振荡10-40分钟。

5．随后取100-600 ul铺平板，于37℃温箱培养12-16小时。

五、注意事项

1．制备感受态细胞前，一定要保证培养的宿主菌处于对数生长期且繁殖代数应基本一致，这也是细菌做转接培养并测其OD值的原因。

2．制备感受态细胞的过程中，每一步操作的动作要轻柔，尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。

3.在实验室制备的感受态细胞做转化42℃热休克并冷却时，时间要准，动作要快。从公司购买的感受态细胞，可以省略这一步。

4.转化菌涂平板前抗生素的量要足够，涂布细菌时菌量不要太多，培养时间不要超过16小时。否则抗生素会失效，未转化菌也会生长。