第二章.组织培养的原理

1、细胞水平的再分化
首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶 水平的变厚和明显的机能分化，从而形成各种 类型的细胞 ①生长调节剂 ：细胞分裂素、生长素、其他生 长调节剂 ②营养物质 ：如糖类等 ③其他理化因子：温度效应、光照效应、PH值
2、组织水平的再分化
拟分生组织：指培养物中出现的类似分生组织的 细胞群，它是指脱分化之后的培养物发生的一系 列细胞分裂而产生的一团小型、壁薄、液泡小、 细胞核和细胞质染色较深的细胞组成，它具有分 化上的可塑性。
器官发生途径：组织培养过程中，再生植 株不是通过胚胎，而是通过分生中心直接 分化器官，最终形成完整植株的过程。 器官间接发生途径 器官直接发生途径
植株再生
体细胞胚
植株
外植体分化 不定器官
具有根茎两极器官
单极器官
先茎后根 先根后茎
植株 植株 植株
二、愈伤组织培养
1、愈伤组织的形成 （1）诱导期 （2）分裂期 （3）分化期
（二）、再分化
再分化（redifferentiation):经脱分化的组织 或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同 功能细胞的能力。
再分化是指离体培养物由脱分化状态再度分 化，再分化可以在细胞水平、组织水平和器官水 平递进的进行，最后再生完整植株。培养物的再 分化，通过胚胎发生和直接分化器官再形成植株 这两个途径实现。
当把一个已经失去了分裂能力，处于分化成
熟和分裂静止状态的细胞置于特定的增殖培养基 上时，它首先发生的变化是回复到分生性状态， 这一状态包括由溶酶体的活动而将失去功能的细 胞质组分降解，并产生新的细胞质组分(即细胞器 的破坏与重建)，同时细胞内酶的种类与活性发生 改变，蛋白质合成和细胞代谢过程也发生改变， 最后引起基因表达的改变，细胞的性质和状态发 生了扭转，可以说是返老还童。由失去分裂能力 的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分 化的细胞团即愈伤组织的现象(或者说是过程)称 为脱分化。
根、 芽
织
植物体
外植体脱分化是实现植物细胞全能性的第一 个步骤，其结果直接影响离体培养的成功与否。 只有掌握好如何调控外植体的脱分化，才能使组 织培养向预期的方向发展。
一、脱分化和再分化
（一）脱分化 1.概念
分化（differentiation）:随着植物的生长，细胞 在形态结构和功能上发生永久性(不可逆转性)适 度变化的过程就叫做分化。 分化的结果导致细胞分裂能力的丧失，伴随 的是细胞的分化、成熟与组织的形成，是植物根、 茎、叶、花、果实和种子的形成，是一个成熟植 物体的出现。在正常的自然状态下，这些已经分 化的细胞不会再恢复分裂能力重新开始细胞分裂， 直到植物体死亡为止。
培养基组分和附加物的作用
提高无机P含量促进器官分化； 糖的平衡可以逆转生长素/激动素的比例； 不加还原氮有利于根的形成。 一些附加的生理活性物质。
物理环境
固态培养基有利于器官变化； 光对器官分化有重要作用；
1000-1500lux是许多培养物的合适光照； 16hr光照符合器官发生的要求； 近紫外和蓝光刺激芽的发生，而红光显著的促进长根； 一般日光灯提供光源。
脱分化（dedifferentiation)：当外植体已 分化的细胞，在切割损伤和培养物内外因 素的作用下，逐渐丧失其原有分化的结构 和功能，合成代谢变得旺盛，细胞壁由厚 变薄，其内部结构也发生变化，细胞高度 液泡化，形成无组织的细胞团或愈伤组织。
外植体脱分化是实现植物细胞全能性的第 一个步骤，其结果直接影响离体培养的成 功与否。只有掌握好如何调控外植体的脱 分化，才能使组织培养向预期的方向发展。
第二章.植物组织培养的基础
本章内容
第一节 细胞全能性和细胞分化 第二节 离体条件下植物器官的发生 第三节 影响植物离体形态发生的因素
第一节.细胞全能性和细胞分化
植物细胞的全能性（totipotent)：植物细胞具有 该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有 发育成完整植物体的潜在能力。
分化：
早期胚
受 精
胎发育
种 分化
组 形成 器 构成
植 物
卵
子
织
官
体
脱分化
外 植
脱分化
愈 伤
再分化 组
组
织
形成
体
织
器 构成 官
植 物 体
愈伤组组织：
从植物的各损伤 的外植体增值而 形成的一种无特wk.baidu.com定结构和功能的 细胞团。
2、脱分化过程中细胞生物学变化
气体交换率增加 RNA随体的合成 过氧化物酶增加 蛋白质活跃合成 酚类物质增加 乙烯合成
1.遗传性的差异
不同植物种间，由于其遗传性的不同，起 源也不尽相同，细胞培养条件有较大差异。
不同品种，培养条件差异很大
2.生理状态的差异
同一植株的不同部位细胞，培养条件差异 很大
细胞的再生能力与其分化程度呈负相关， 就是说细胞分化程度越高其再生能力越低
差异：（1） 受精卵的全能性最高
（2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全
25℃左右的培养温度，能模拟培养植物原产地温度 更为有利。
4、 植株再生
再生植株:组织培养过程中所采用的外植体 经过 诱导能够重新进行器官分化,长出芽、根、花等器 官，最后形成完整的植株，这种经过离体培养的 外植体重新形成的完整植株成为再生植株。
植株再生途径： （1）胚状体途径 （2）器官发生途径
原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特 有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必 需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活 细胞都应该具有全能性。
潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞， 在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作 用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植 株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组 织培养。
3、与脱分化有关的因子及其作用
（1）损伤刺激。 损伤形成的特殊刺激是引起脱分化的第一个
因子。损伤首先导致外植体产生生化响应，损伤 导致气体交换率变化和呼吸活性变化，还导致很 多酶活性增加，一些代谢物的含量也变化。 （2）培养细胞的异质性
用茎等典型的各种已分化的细胞类型的复合 体作为外植体，细胞之间存在很大的异质性，异 质细胞对培养条件的刺激有不同的敏感性，因此 可能只有某种类型和某一部分的细胞可以脱分化 以至分裂，其他细胞则不能。异质性的方面主要 是指不同的倍数体和不同的生理状态。
（1）胚状体途径
胚状体：在组织培养过程中，许多离体的 细胞、组织、器官可以通过与合子形成相 类似的过程（即通过原胚期、球形胚期、 心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期而）形成 的类似胚的结构，这种类似胚的结构与合 子胚的来不同，被成为胚状体。
胚状体途径：外植体按胚胎发生方式形成 再生植株的过程。
（2）器官发生途径
能性比生殖细胞的低。
3.位置效应
位置效应：同一植株的同一类型外植体进 行培养，而且管理条件完全相同，但是这 些外植体的分化情况也有较大差异 。
原因：内源激素分布梯度
第二节 离体条件下植物器官的发生
植物体细胞培养产生完整植株示意图
细胞培养形成的胡萝卜植株
组织培养过程
外
愈
植 体
脱分化 伤 组
再分化
维管组织结节：是一个区域的愈伤组织转化为韧 皮分子和木质分子的混合体结构，这样的形成层 状的细胞向外延伸与拟分生组织连接，形成根原 基或芽原基，可以认为维管结节是试管植株维管 束的前身。
3、器官水平的再分化
影响根、茎器官分化的因素 1、控制器官分化的激素模式——生长素/激动素
生长素/激动素的相对高水平，有利于根的生成； 生长素/激动素的相对低水平，则有利于地上部的形成； 二者的比例趋中时，促进愈伤组织的生长。 但是生长素和激动素的需要因组织和系统不同而异，二者的 性质也影响器官发生。因此在使用中注意二者的种类、 浓度比例。
（3）生长调节剂的影响
创伤可以引起少数细胞的分裂，但是切 面上易于形成多酚物质沉淀形成的保护层， 从而使得表面细胞停止分裂，加入2，4－D 等激素后，导致外植体细胞生物学和细胞 分裂的更强烈的变化，结果进入第一次分 裂的细胞百分率更高。
（4）培养环境的影响
光线对外植体最初的分裂有明显影响，外植 体在DNA复制开始后，对光线不敏感，在后续培 养期间，光线对生长也很少有刺激作用。
2.愈伤组织的生长
3.愈伤组织的保持
大多数情况下， 随继代培养代数 的增加和培养时 间的延长，愈伤 组织表现出生长 势下降、褐变、 分化和形态发生 能力逐渐减低甚 至死亡或形态发 生能力完全丧失。
第三节 影响植物离体形态发生的因素
一、植物种类和基因型 二、培养材料的生理状态 三、培养基 四、培养条件
思考题
1、概念：脱分化、再分化 2、与脱分化有关的因子及其作用 3、影响根、茎器官分化的因素 4、植物组织培养有哪些类型