原核表达系统三大要素的选择及优化

原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株

菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌

原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体

质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱

启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

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复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。常用的高拷贝复制子包括pCoE1，pMBI (pUC)等。

融合标签：融合标签是与目的蛋白共同表达的一段多肽。较小的融合标签（如His-tag）一般不影响重组蛋白的结构和功能；较大的融合标签（如GST）可以帮助蛋白表达和折叠，提高蛋白溶解度。N端标签自身带有启动子和宿主偏好密码子，可以提高蛋白表达量，但提前中止的蛋白片段也会一并被纯化；C端标签则可保证只有完整的蛋白得到纯化。标签位置还应该避免位于蛋白重要功能区末端。

筛选标记：在没有压力的培养环境下，宿主中的外源质粒常随着复制而丢失。为了稳定

质粒表达，需要在质粒载体中加入筛选标记，使宿主在压力环境下生长。常用的抗生素筛选标记有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性和四环素抗性等。需要根据不同的菌株和培养环境，选择合适的筛选标记。

3. 优化表达条件

新建的重组蛋白表达系统常常会出现蛋白不表达、或表达量不理想等情况。为了提高重组蛋白表达量、改善蛋白质量，一般都需要对表达条件进行优化。原核表达条件的优化主要从以下几方面考虑：

蛋白不表达：如果重组蛋白不表达，首先检查cDNA和质粒是否正确，然后尝试更换菌株、质粒载体、标签等。通常原核来源的蛋白不能表达的情况很少见，如果是真核蛋白不能表达，还可以更换表达系统，尝试酵母或昆虫细胞表达系统。

蛋白表达量低：宿主菌蛋白的密码子使用频率一般是不同的，有最佳密码子、偏好密码子、稀有密码子和利用率最低的密码子。检查目的蛋白的密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。如果重组蛋白N端存在大量集中稀有密码子，会降低mRNA的稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止，将这些稀有密码子突变成宿主偏好的密码子，能够显著提高蛋白表达水平。另一种方法，还可以将菌株更换为提供稀有密码子tRNAs的菌株（如Rosetta）。此外，高GC含量、回文结构和相距较近的两个起始密码子都会阻碍转录启动。

可溶表达低：如果重组蛋白可溶表达低，可尝试降低诱导后培养温度，引导重组蛋白降低表达速度，提高正确折叠率，一般25-30℃就能明显改善蛋白折叠。重组蛋白在所有细胞中表达水平相当时，减少诱导剂可明显增加蛋白可溶表达量。使用M9ZB和NZCYM培养基，可增加细菌的拷贝数；使用LB培养基，可提高外源蛋白的表达量。

高毒性蛋白：宿主菌的生长会受到外源基因表达的影响。经过改造的宿主在很大程度上能够容忍重组蛋白，重组蛋白可以占到细胞总蛋白量的50%以上。但少数高毒性蛋白的本底表达会杀伤宿主，导致质粒丢失，所以需要降低重组蛋白的本底表达量。采用的方法包括在培养基中加入1%的葡萄糖、使用严格启动和低拷贝数的载体、选择可表达T7溶菌酶的宿主等。除此之外，还可以通过共表达重组蛋白抑制剂、提高抗生素浓度等方法提高重组蛋白表达量。

包涵体表达：过量表达的重组蛋白会在大肠杆菌细胞内凝聚，形成无活性的包涵体沉淀。包涵体蛋白的优势在于能够轻松获得超高表达量，不可溶蛋白不会被宿主蛋白酶降解，重组蛋白毒性被大大抑制，蛋白纯度高且易纯化；其缺点在于包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对

混乱、没有生物活性、需要变复性。提高培养温度、延长培养时间、加大菌密度都有利于诱导包涵体形成。