第三章 免疫酶组织化学技术

一、酶标抗体免疫组织化学染色法
（一）原理 直接法和间接法。
直接法--是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法---两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因 为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。)
双PAP法染色程序：
⑴～⑽ 同PAP法。 ⑾ 用PBS洗2次，每次5min。 ⑿ 再加桥抗体(羊抗兔IgG抗体，比第一次稀释大一倍)， 湿盒内室温孵育30min。 ⒀ PBS洗2次，每次5min。 ⒁ 再加PAP复合物(比第一次稀释大一倍)，湿盒内孵育 30min。 ⒂ 以后按上述PAP法12～15进行。
1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥后,入PBS。
2）0.3％H2O2 -甲醇液处理30’,封闭内源性过氧化物酶; 3）0.0l mol／LPBS洗3次。
4) 5％-10％正常羊血清室温处理30min。
5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体, 37℃孵育60’或4℃过夜。 6) 0.0l mol／L PBS洗3次。 7) DAB／H2O2显色(新鲜配制)。 8) 0.01mol／LPBS洗3次。 9) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
2 间接法
1) 石蜡切片脱蜡至水；
冰冻切片 室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂
2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS漂洗
4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育 液,不冲洗.
5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。
其它免疫组化方法

免疫组化技术成熟的过程=提高IHC敏感性=提高放大 信号=抗原+？酶
生物素(Biotin) ：Vitamin H、 活化后可标记抗体和酶而不影响其活性 卵白素(Avidin):亲和素、抗生物素 碱性蛋白质；具有4个生物素结合位点 链霉卵白素： 从链霉菌中提取出来，等电点接近中性，对组织细胞的非特异 吸附很低，是与生物素结合更加完美的一种蛋白质。 生物素-卵白素、生物素-链霉卵白素： 具有高度亲和力，是抗原抗体结合能力的上千倍。
非标记抗体酶法
--PAP法
原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体-酶制成 复合物（PAP复合物），形成抗原-抗体1PAP复合物。 优点：比直接法、间接法、酶桥法更敏感。 特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减 弱抗原的检测。 缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床 常规检查。
双PAP法

优点：
① PAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法
酶标抗体法-直接法
原理：将酶直接标记在一抗上， 然后直接与相应抗原特异地结合。 形成抗原-抗体-酶复合物，最后 用底物显色剂显色。
优点：简便、快速、特异性强， 非特异性背景反应低。 缺点：浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及 抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶 标记物。
2

碱性磷酸酶
ALP：


显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚 AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等 偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。
(二) PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法）
PAP复合物：
抗酶抗体 + 足量的酶 == 形成稳定的五角形复合物 (由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成)
原理：三种抗体
PAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。 一抗 二抗---桥抗体 PAP复合物
要求：
抗酶抗体的动物种属应和制各第一抗体的动物相同。
ABC法反应原理
ABC染色程序
⑴～⑸同上述酶标抗体法。 ⑹ 加第一抗体,湿盒内4℃孵育16～24h。 ⑺ 用PBS洗2次,每次5min,可振摇。 ⑻ 加生物素化抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30’ ⑼ 用PBS洗2次，每次5’，可振摇。 ⑽ 加ABC复合物(亲合素一生物素过氧化物酶复合物 ),湿盒内室温孵育3’ ⑾ 用PBS洗2次,每次5’。再换入Tris缓冲液洗5’。 ⑿ 用TBS配制的H2O2-DAB底物显色5～10’(镜下观察控制)。 ⒀ 流水冲洗。 ⒁ 需要时可复染细胞核。 ⒂ 脱水、透明、封固。
SP/SAP法
该法是ABC法基础上的进一步改良. 与链霉卵白素（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有四 个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。
优点：更简洁，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。 分子量小，穿透力↑。
一抗 + 生物素标记二抗 + 辣根酶标记链霉卵白素 + 辣根酶底物显色
其它免疫组化方法-ຫໍສະໝຸດ Baidu--SP
呈色反应注意要点：
① 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; ② pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; ③ 温度： 室温即18℃-22℃，或37℃； ④ 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制，
以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可 终止反应。
（二）染色程序
1 直接法（冰冻切片）
免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记
的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶 性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确 定该抗原的性质、存在的部位和含量。

显色反应 :

酶 + 底物====不溶性的色素
标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) β-D-半乳糖苷酶……
5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,或室温2～4h。
6) PBS充分冲洗 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体,湿盒孵育45～60’(室温或37℃)。 8) PBS漂洗(3次,每次2-5’)。
9)显色： ① HRP标记抗体（0.01-0.1% H2O2 + 0.01-0.5％DAB液） ② ALP标记抗体 （2mg磷酸萘酚AS-MX+0.2ml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TR盐)。 切片入此液,室温10～15’。 ③ GOD标记抗体 （β-D-葡萄糖67mg + 硝基蓝四唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯0.107mg， 37℃孵育1h。 10) 流水中终止呈色反应； 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s 12) DAB显色标本-----树胶封固。 其它------------水溶性介质(如甘油明胶)封固。 13) 镜检结果：按上法HRP阳性者呈棕色，ALP法阳性者呈红 色，GOD法阳性者呈蓝色。
2 酶桥法染色程序 ⑴～⑸同上述酶标抗体法。 ⑹ 滴加第一抗体,于湿盒内4℃孵育16～24h。 ⑺ PBS洗2次，每次5’(可振摇)。 ⑻ 加第二抗体(桥抗体),湿盒内室温孵育30～60’。 ⑼ 用PBS洗2次,每次5’。 ⑽ 加抗酶(HRP)抗体,湿盒内室温孵育30～60’。 ⑾ 用PBS洗2次,每次5’。 ⑿ 加过氧化物酶(HRP)溶液(70～100μg／m1),湿盒内室温 孵育30’。 ⒀ 用PBS洗2次,每次5’。换Tris缓冲液洗5’。 ⒁ 显色反应及后处理同酶标记法。
第三章 免疫酶组织化学技术
免疫酶组织化学技术
酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶…… 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab)
抗原抗体复合物(酶标) 底物
有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量
免疫组化方法

酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法

非酶标抗体免疫组织化学
酶桥法 PAP法、APAAP法
③ 由于PAP复合物分子量较大，对组织的穿透力不如酶标抗体，故不适
于免疫电镜标本制作。
2 PAP染色程序
⑴～⑸同上述酶标抗体法。 ⑹ 加第一抗体,湿盒内4℃孵育16～24h。 ⑺ 用PBS洗2次,每次5min,可振摇。 ⑻ 加桥抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30’ ⑼ 用PBS洗2次，每次5’，可振摇。 ⑽ 加PAP复合物(由兔制备抗酶抗体),湿盒内室温孵育3’ ⑾ 用PBS洗2次,每次5’。再换入Tris缓冲液洗5’。 ⑿ 用TBS配制的H2O2-DAB底物显色5～10’(镜下观察控制)。 ⒀ 流水冲洗。 ⒁ 需要时可复染细胞核。 ⒂ 脱水、透明、封固。
非标记抗体酶法 — 酶桥法
原理：首先用酶免疫动物，制备 效价高、特异性强的抗酶抗体； 以二抗作桥，将抗酶抗体联结在 一抗上； 再将酶结合在抗酶抗体 上，形成抗原-抗体1-抗酶抗体-酶 复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：任何抗体均未被酶标记。 酶是通过免疫学原理与酶抗体结 合的。避免了共价连接对抗体和 酶活性的损害，提高了方法的敏 感性，而且节省一抗的用量。 缺点：敏感性低，抗酶抗体不易 纯化。
酶桥法的缺点：
① 抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体；
低亲和力抗酶抗体--与酶结合力较弱，漂洗时易解离，
可使约70％的酶丢失，因而降低了方法的敏感性；
②在抗酶抗体内，也含有非特异性(抗酶)抗体，因其抗 原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未 与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。
高20倍； ② PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色；
③ 双PAP法：通过两次连接桥抗体和PAP复合物，在抗原抗体复合物上结 合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和 抗原性减弱的抗原检测。

缺点：
① PAP复合物制备较复杂； ② 免疫染色步骤多、需时长；
酶标抗体法-间接法
原理：将酶标记在二抗上，先将 一抗与相应的抗原结合，形成抗 原抗体复合物，再用二抗(酶标抗 体)与复合物中的特异抗体结合， 形成抗原-抗体-酶标抗体复合物， 最后用底物显色剂显色。 优点：只需一种酶标抗体即可 。 缺点：敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及抗体活性有 影响。
3 GOD(葡萄糖氧化酶)：
以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为
HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是 小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗
体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又 含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。
ABC法
、SP法、SABC法、EnVision法、CSA法……
ABC法（亲和素－生物素－过氧化物酶复合物法）


亲和素Avidin: 糖蛋白，其上有四个与生物素相结合的位点。 生物素Biotin：维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。 ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。 1）ABC复合物的制备：
二、非酶标抗体免疫组织化学染色法
酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAP (一) 酶桥法 1 原理：三种抗体 一抗 二抗---桥抗体 三抗----抗酶(HRP)抗体, 酶(HRP)与抗酶抗体结合,经底物的显色反应将抗原显示出来。
优点：任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, 避免因 共价结合对抗体和酶活性的影响,敏感性高, 可节约一抗。 需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。
1 辣根过氧化物酶 HRP：
显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期 保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃ 贮存。 注意事项：孵育时间和配臵方式易产生背景着色 浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2
（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色)
原理： + 一抗 + 生物素化二抗 + HRP标记的链霉卵白素 优点：
高灵敏度 低背景 操作方便
缺点：
不适用于内源性生物素丰富的组织

三步法（以SP试剂盒为例）
• 石蜡切片脱蜡至水。 • 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 • 3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2 分钟×3次。 • 5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当 比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。 • PBS冲洗，2分钟×3次。 • 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育1030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。 • PBS冲洗，2分钟×3次。 • 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。 • PBS冲洗，2分钟×3次。 • 显色剂显色（DAB或AEC）。 • 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。