3载体与宿主系统介绍
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P准st配I 置序列。在MCS中，每 Ava I
个限制性酶o切ri 位点Pv通u I常I 是唯 一的。
载体的分类
按照功能分类：
克隆载体：一种能够携带外源基因或DNA片段进入宿主 细胞，并使其大量扩增的复制单元。
表达载体：能够携带外源DNA片段进入宿主细胞进行复制、 转录和翻译的载体。
按载体的来源：
质粒载体，噬菌体载体，粘粒载体，人工染色 体载体等
ROI ROP
Bal I
Origin of Replication Hind II
pBR322的负筛选
ApR TcR
pBR322
+
ApR
Tcr
pBR322 gene
23
1
4
5
Ampicillin
插入失活筛选法
外源DNA片段插入到载体的选择标 记基因中而使此基因失活,丧失其原 有的表型特征。
Tetracycline
3. TA 克隆和TA载体
1. pBR322质粒 2. pUC质粒 3. TA载体
1. pBR322质粒
pB322特性
分子量较小
Pvu I
具有氨苄青霉素和Pst I
四环素两种抗性标
记
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
43613 bp
具有较高的拷贝数 15 – 20
线形（L型）：闭合环状DNA分子双
链断裂，质粒变成一条线性分子。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
L
移 动
OC
方
向
L
移
OC
动 方
OC
向
L
SC
SC
SC
3
（三） 质粒载体的构建
常用的质粒载体改造手段
1. 选择合适的复制起始位点； 2. 加入合适的选择标记基因； 3. 增加或减少酶切位点，引入多克隆位点； 4. 缩短长度。
2016/12/10
4
2016/12/10
2. pUC质粒
特点： 1）与pBR322相比 具有更小的分子量 和更高的拷贝数。
2）具有LacZ基因， 适于蓝白斑筛选。
3）多克隆位点酶切 位点更多。
2686 bp
MCS
蓝白筛选法
lacZ
肽
pUC18
X-gal -半乳糖苷酶 (无色）
-半乳糖苷酶
-互补 ( -complementation)
根据拷贝数的数多少，质粒可分为两大复制类型：
严谨型（stringent plasmid）：在细胞中的拷贝数 较少，一般1至数个。
松散型（relaxed plasmid）：这类质粒拷贝数较 多，一般在10个以上。
2. 质粒的不相容性（incompatibility)
质
概念：在没有选择压力的情况下，不同的质粒
粒 不
在同一宿主细胞中不能稳定共存的现象。
相
容
性
注意： 亲缘关系近的质粒一般属于不相容性质粒。
的 机
野生型质粒与其衍生的重组质粒通常属于不亲和性质
制
粒，因此作为受体细胞最好不含内源质粒。
3. 质粒DNA的构型
闭合环形（SC型）：两条链均
保持完整的环形结构。
开环形（ OC型 ）：两条链
只有一条保持完整，另一条链出 现切口。
2016/12/10
基因怎么转入受体？
？
目的基因
受体生物
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去！能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。
基因工程
第三章 载体和宿主系统
Chapter 3 Vectors and Host System
第五章 载体（Vector)
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 宿主系统
载体的概念
在基因工程中，把能够携带外源基因 （或DNA片段），进入细胞复制、整合或 表达的DNA分子就称为载体（Vector）。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
1
2016/12/10
（二） 质粒的基本性质
1. 质粒的复制与拷贝数
质粒的复制：质粒有自己的复制起始区（ori)和相关顺式 元件，能独立于宿主细胞的染色体外利用宿主细胞的DNA复
制系统进行自主复制。
RNA II 3’
复制方向 5’
5’
RNA I
ori
3’ rop
E.coli ColE1 plasmid
（+） Rop
质粒的拷贝数：在正常生长条件下，每个细菌细胞 中所含的质粒的平均数。
大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和底物X-Gal 相互作用 释放出一种蓝色物质。该酶由-和-两个片段构成。将 编码-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧 翼序列中，而大肠杆菌株系中却只能编码片段。LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 片段就能和寄主编码的片段发生互补从而具有了对底 物X-gal的作用功能这种现象被称为是 -互补 。
质粒的本质：绝大多数的质粒是DNA型的，但是在自 然界还发现了RNA质粒，如酵母的杀伤质粒(killer plasmid)。 质粒的长度：多数质粒DNA分子在10 kb左右，小的 不足2 kb，大的可达100 kb以上，DNA分子很大的质 粒也称为巨型质粒分子量范围1-200 Kb
2
2016/12/10
理想基因工程载体必须具备的条件
① 能高效地进入宿主细胞
② 能在宿主细胞中复制和 繁殖，实现外源基因的 增殖
③ 有多克隆位点，可供外 源基因的插入
④ 有供选择转化子的标记 基因。
多克隆位点（multiple EcoR I Hind III
cloning site, MCS），是包含 多个限制性酶切位点的Ba一m段H I a很m短pr的DNA序列，是基因S工al I 程中常用到pB的R载32体2 质粒t的er标r
按受体细胞：
原核生物载体和真核生物载体
第一节 克隆载体
一．质粒载体 二．噬菌体载体 三．人工染色体载体
一.质粒载体(Plasmid)
（一） 质粒的概念
一种存在于真核细胞细胞核外或原核生物的拟核区外，能
够独立复制的双链环状DNA分子（极少数为线型或RNA）。
大 肠 杆 菌 的 质 粒
质粒的宿主：质粒广泛存在于细菌细胞中，也出现在 某些蓝藻、绿藻、眼虫、衣藻和真菌等细胞中。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几 个野生型质粒构建的：
pSC101： 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1： 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ： ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
（四）常用的质粒载体
个限制性酶o切ri 位点Pv通u I常I 是唯 一的。
载体的分类
按照功能分类：
克隆载体：一种能够携带外源基因或DNA片段进入宿主 细胞，并使其大量扩增的复制单元。
表达载体：能够携带外源DNA片段进入宿主细胞进行复制、 转录和翻译的载体。
按载体的来源：
质粒载体，噬菌体载体，粘粒载体，人工染色 体载体等
ROI ROP
Bal I
Origin of Replication Hind II
pBR322的负筛选
ApR TcR
pBR322
+
ApR
Tcr
pBR322 gene
23
1
4
5
Ampicillin
插入失活筛选法
外源DNA片段插入到载体的选择标 记基因中而使此基因失活,丧失其原 有的表型特征。
Tetracycline
3. TA 克隆和TA载体
1. pBR322质粒 2. pUC质粒 3. TA载体
1. pBR322质粒
pB322特性
分子量较小
Pvu I
具有氨苄青霉素和Pst I
四环素两种抗性标
记
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
43613 bp
具有较高的拷贝数 15 – 20
线形（L型）：闭合环状DNA分子双
链断裂，质粒变成一条线性分子。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
L
移 动
OC
方
向
L
移
OC
动 方
OC
向
L
SC
SC
SC
3
（三） 质粒载体的构建
常用的质粒载体改造手段
1. 选择合适的复制起始位点； 2. 加入合适的选择标记基因； 3. 增加或减少酶切位点，引入多克隆位点； 4. 缩短长度。
2016/12/10
4
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2. pUC质粒
特点： 1）与pBR322相比 具有更小的分子量 和更高的拷贝数。
2）具有LacZ基因， 适于蓝白斑筛选。
3）多克隆位点酶切 位点更多。
2686 bp
MCS
蓝白筛选法
lacZ
肽
pUC18
X-gal -半乳糖苷酶 (无色）
-半乳糖苷酶
-互补 ( -complementation)
根据拷贝数的数多少，质粒可分为两大复制类型：
严谨型（stringent plasmid）：在细胞中的拷贝数 较少，一般1至数个。
松散型（relaxed plasmid）：这类质粒拷贝数较 多，一般在10个以上。
2. 质粒的不相容性（incompatibility)
质
概念：在没有选择压力的情况下，不同的质粒
粒 不
在同一宿主细胞中不能稳定共存的现象。
相
容
性
注意： 亲缘关系近的质粒一般属于不相容性质粒。
的 机
野生型质粒与其衍生的重组质粒通常属于不亲和性质
制
粒，因此作为受体细胞最好不含内源质粒。
3. 质粒DNA的构型
闭合环形（SC型）：两条链均
保持完整的环形结构。
开环形（ OC型 ）：两条链
只有一条保持完整，另一条链出 现切口。
2016/12/10
基因怎么转入受体？
？
目的基因
受体生物
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去！能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。
基因工程
第三章 载体和宿主系统
Chapter 3 Vectors and Host System
第五章 载体（Vector)
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 宿主系统
载体的概念
在基因工程中，把能够携带外源基因 （或DNA片段），进入细胞复制、整合或 表达的DNA分子就称为载体（Vector）。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
1
2016/12/10
（二） 质粒的基本性质
1. 质粒的复制与拷贝数
质粒的复制：质粒有自己的复制起始区（ori)和相关顺式 元件，能独立于宿主细胞的染色体外利用宿主细胞的DNA复
制系统进行自主复制。
RNA II 3’
复制方向 5’
5’
RNA I
ori
3’ rop
E.coli ColE1 plasmid
（+） Rop
质粒的拷贝数：在正常生长条件下，每个细菌细胞 中所含的质粒的平均数。
大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和底物X-Gal 相互作用 释放出一种蓝色物质。该酶由-和-两个片段构成。将 编码-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧 翼序列中，而大肠杆菌株系中却只能编码片段。LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的 片段就能和寄主编码的片段发生互补从而具有了对底 物X-gal的作用功能这种现象被称为是 -互补 。
质粒的本质：绝大多数的质粒是DNA型的，但是在自 然界还发现了RNA质粒，如酵母的杀伤质粒(killer plasmid)。 质粒的长度：多数质粒DNA分子在10 kb左右，小的 不足2 kb，大的可达100 kb以上，DNA分子很大的质 粒也称为巨型质粒分子量范围1-200 Kb
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2016/12/10
理想基因工程载体必须具备的条件
① 能高效地进入宿主细胞
② 能在宿主细胞中复制和 繁殖，实现外源基因的 增殖
③ 有多克隆位点，可供外 源基因的插入
④ 有供选择转化子的标记 基因。
多克隆位点（multiple EcoR I Hind III
cloning site, MCS），是包含 多个限制性酶切位点的Ba一m段H I a很m短pr的DNA序列，是基因S工al I 程中常用到pB的R载32体2 质粒t的er标r
按受体细胞：
原核生物载体和真核生物载体
第一节 克隆载体
一．质粒载体 二．噬菌体载体 三．人工染色体载体
一.质粒载体(Plasmid)
（一） 质粒的概念
一种存在于真核细胞细胞核外或原核生物的拟核区外，能
够独立复制的双链环状DNA分子（极少数为线型或RNA）。
大 肠 杆 菌 的 质 粒
质粒的宿主：质粒广泛存在于细菌细胞中，也出现在 某些蓝藻、绿藻、眼虫、衣藻和真菌等细胞中。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几 个野生型质粒构建的：
pSC101： 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1： 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ： ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr
（四）常用的质粒载体