昆虫分子鉴定技术简介

spp．制作的装饰品和一些珍惜鞘翅目昆虫标本。
医学昆虫学：为研究关于吸血性昆虫与其脊椎动物寄主的相互关系提供了一个 快速通用的鉴定工具。如选取蚊、库蠓、锥猎蝽吸食的血液，结果鉴定出将近40种脊椎
动物寄主，包括23 种鸟类、16 种哺乳动物以及1 种爬行动物。
DNA 序列比对与分析
序列分析即利用生物信息学软件统计分析序列差异，主要包括进化
树法（tree based methods）、距离法（distance based methods）和特征法
（character based methods），前两者主要包括邻接法、BLAST搜索或使 用软件分析碱基遗传距离等，后者主要包括DNA序列中核苷酸的组成、
保护决策更科学合理
（宏条形码技术）。
在一些生物多样性调查研究中，DNA条形码鉴定物种的准 确率达到了97%
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在应用昆虫学中的应用
保护生物学：此外，为执法部门的科学执法提供了强有力的保障，如利用DNA条
形码还可以及时地检查出非法交易中受保护的濒临灭绝昆虫，如由鸟翼凤蝶 Ornithoptera
MP、ML法和BI法是基于特征的方法，通过比较 所有序列的每个位点，计算每棵树的得分。NJ法 为 基 于 一 定 的 进 化 模 型 ， 如 ： K-2-P 模 型 、 pdistance等，计算出各序列间的遗传距离，构建距 离矩阵，进而构建系统发育树。
DNA 序列比对与分析
距离法
距离法是通过计算物种间的遗传距离来鉴定物种，根据条形码间隙的概念， 即种内遗传距离和种间遗传距离之间应存在一个距离间隙，或通过定义一个能区 分种内、种间遗传距离的阈值，将未知物种鉴定为已知物种或定义为新种。 TaxonDNA是基于遗传距离分析条形码鉴定效率的程序（评价方法：最佳匹配方法
榛梢木蠹象Pissodes terminalis在数据库里的比对结果1
榛梢木蠹象Pissodes terminalis在数据库里的比对结果2
http://www.boldsystems.org/
以每年30 万个样本的速度在扩充
截至2015年3月，已有DNA条形码序列3,866,134条，包括157,057种动物、62,025种植 物和16,837种真菌及其他生物类群。
在昆虫分类学中的应用
探讨系统发育关系：
尽管 DNA 条形码的目的不 是为了构建系统发育树， 但是条形码所使用的 COI 基因本身就包含着一定的 系统发育信息， 通常认为 可以用来探讨一些低级阶 元的系统发育关系。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在昆虫分类学中的应用
分析区系组成：如利用DNA条形码技术对罗马尼亚的鳞翅目1387个标本的种类进行全面
在昆பைடு நூலகம்分类学中的应用
其他用途均是由这两个用途衍 生出的。
鉴定物种：在双翅目、膜翅目、鞘翅目、
蜉蝣目、弹尾目、直翅目、蜻蜓目、缨翅 目、襀翅目和毛翅目等中 DNA 条形码也被 证实可以很好地区分物种。
确定虫态关系： 可以对通常形态上无
法鉴定的尤其是完全变态的幼虫、蛹、卵 等虫态进行分类。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
2、DNA条形码
预先收录已知物种的 cox1 基因 - 建 立数据库-未知种名物种 cox1输入检索据相似度鉴定物种。
DNA 条形码的操作流程主要有以下几 个步骤：1)标本采集、整理、鉴定、描述； 2)基因组DNA提取；3)DNA条形码标准基因 的 PCR扩增； 4)PCR 产物纯化及 DNA 序列测 定；5)DNA 序列比对与分析。
二、昆虫DNA条形码
1、DNA分类
Tautz于2002年提出DNA分类的概念（DNA Taxonomy ），以DNA序列为 基础建立物种识别体系，利用DNA序列的差异进行种级阶元的分类，并与林 奈命名系统一一对应。（可以解决一些形态学上的难题，发掘隐存种）
二、昆虫DNA条形码
2、DNA条形码
理想的DNA条形码应符合一些基本标准: (1)具 有足够的遗传变异性和一定的分化度，可以区分不 同的物种，同时种内变异小，具有保守性。(2) 必 须是一段标准的 DNA 片段来尽可能的鉴别不同的 分类群。(3)目标 DNA 区应该包含足够的系统进化 信息，用以定位物种在分类系统中的位置。 (4) 具 有高度保守的引物设计区，便于通用引物的设计。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在昆虫生态学中的应用
推断气候变化对昆虫的影响：如通过形态结合 DNA 条形码的方法调查20 世纪中期及
其50～70 年后加拿大极地Churchill地区的一些寄生蜂的多样性，并比较这两个时期的物种多 样性的改变，结果发现在这50～70年间，这些地区的物种组成确实随着温度的升高发生了显 著的变化。
长度适中。
该基因不存在内含子，是 蛋白编码基因，所以便于比对， 且可通过翻译检测错误，极少出 现重组、 插入和缺失。
3014 1460
UEA5/UEA6、UEA7/UEA8和UEA5/UEA8：相对保守——高水平（科、属、种） 系统发育研究 UEA3/UEA4 (or UEA4d) 和UEA9/UEA10：较为变异——种群遗传学研究（种内 或近缘物种系统发育）
一、昆虫主要的分子鉴定技术
1、分子鉴定技术的必要性
自林奈创立双名法近 250 年来，仅 有 100 多万个昆虫物种被命名，而昆虫 数量巨大（ 1000-2000 万未鉴定），单 靠专业的经典分类学家命名，几乎是不 可能完成的任务。
以平均一个经典分类学家一生鉴定 1000 个物
种的标准来计算，需要 1 万多个经典分类学家同时 参与完成。 昆虫已命名100多万种，占动物界已知种类的2/3。
在昆虫分类学中的应用
发现隐存种与合并异名种：在鳞
翅目等类群中，通过 DNA 条形码发现 了大量隐存种或新种（ Hebert 等在发 现 DNA 条形码序列差异后结合幼虫色 型、幼虫取食植物、生态分布、成虫 头部等特征发现，双带蓝闪弄蝶其实 是个由同域分布的至少 10 个种组成的 复合体。）
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在应用昆虫学中的应用
农业昆虫学：上述 DNA 条形码技术在昆虫分类与生态学研究中应用的很多方面 均可用于农业昆虫学研究中。如利用 DNA 条形码对北美农业生态系统中的天敌昆虫瓢虫
种类进行了分析，发现3种本地物种和2 种入侵物种。
植物检疫：随着参考序列数据库的不断完善， 条形码可用来作为全球范围内快 速准确鉴定外来入侵物种的通用方法。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在应用昆虫学中的应用
保 护 生 物 学 ： 用 DNA 条 形 码 技 术 对 候 选保护区进行评估, 能 全面反映整个生态系统 的物种物种多样性、遗 传多样性、系统发育多 样性和进化潜力等 , 使 该技术将整个混合 样本的DNA片段扩增后 再进行高通量测序，目 前已用于微生物和动物 的相关研究中。
一、昆虫主要的分子鉴定技术
1、分子鉴定技术的必要性
由于经典分类 学方法具有局 限性 （专业技术要求高，相对专一性），很
难同时有效地对某一个地区某一个项目
或某一次大型考察所得到的全部生物样 本进行鉴定与记录。 对形态学分类固有的缺陷，如表型 可塑性和遗传可变性，无法鉴定隐存分 类单元和不同发育阶段的昆虫。
还揭示出剩余的 3 个表面上杂食性的形态种其实都是由具寄主专一性的物种组成的隐存种。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在昆虫生态学中的应用
解析食物链：通常是通过特异 的引物检测植食性昆虫或捕食者 肠道内含物或排泄物中残存的寄
主植物或被捕食者的 DNA 来确
定食物链中的营养关系。如
Kaartinen 等首次应用 DNA 条形码 COI 和 ITS2 序列研究了发生在黑橡 Quercus robor Linnaeus上的潜叶鳞翅 目和造瘿膜翅目组成的食物网中的 物种成员以及相互的关系。
法医昆虫学：法医昆虫学主要是利用尸体上产生昆虫的种类、生长发育情况来
推断死亡时间、地点等，对昆虫进行准确鉴定是开展法医昆虫学研究的前提。一般
成虫易飞走而导致通常收集到的都是卵、幼虫、蛹或者是残肢碎片，这些因为缺乏形态上的 鉴定特征，致使传统的形态鉴定难以实现，以往主要的解决办法就是将幼虫带回去饲养成成 虫后再鉴定，这种方法不仅会拖延大量的时间，而且经常会因为饲养经验不足， 环境不适 应导致幼虫死亡，最后直接影响相关案件的侦破。
从理论上讲，15 个碱基位点就有415种编码方式，这个数目是现存物种的100倍。在蛋白质编码 基因中的第3 位密码子碱基是可以自由变换的。因此，只需一段45个碱基长度的序列便可编码近 10 亿的物种， 所以理论上 DNA 条形码这段648 bp 的序列完全可以鉴定所有物种。
cox1
相对保守又有足
够的变异，并且序列
传统分类学中的形态特征，来鉴定
和描绘物种。该方法已被证实为物 种鉴定的有效方法。
特征法--木蠹象属昆虫DNA条形码检测技术的研发
木蠹象属昆虫的鉴定特征（cox1基因片段长度 371 bp）
利用基因条码分析软件共检测到 46 个多态位点，其规律作为木蠹象属昆虫的鉴定特
征，可以根据特征对该属物种进行准确鉴定。标记性碱基的确定为木蠹象属昆虫的分子快 速鉴定提供了实验依据。
替换与缺失等分析。在分析种以下水平的序列差异时，由于基因距离较
小，使用基于特征的分析方法更为可靠。
DNA 序列比对与分析
进化树法
通过构建系统发育树，以进化树上的物种是
否为单系性为标准来判定未知物种的种类或发现 新种。常用方法有邻接法（ NJ ）、最大简约法
（MP）、最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）。
（BM）和基于阈值的最佳匹配方法（BCM））。通常基于K-2-P模型进行计算。BM方法的
常会导致假阳性的错误鉴定；BCM有所改进，该方法先对数据库中的序列进行统
计分析，得出一个相似性的阈值，即与未知序列遗传距离最小且在阈值范围内的
数据库中的物种为鉴定成功的物种。
DNA 序列比对与分析
特征法 特征法是寻找某分类单元内成 员共享、并可以将其与其他分类单 元区分开的鉴定特征。一个物种中 的固定核苷酸位点的固定碱基可以 作为鉴定该种的诊断特征，类似于
2007年5月，加拿大圭尔夫大学正式筹建生命条形码数据库系统 (Barcode of Life Data Systems，BOLD)。包括序列信息，也包括完整的物种描述、地理分布信息、标本图片等。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
已经开展的昆虫 DNA 条形码计划
最基本的用途就是物种间 DNA 条形码技术在昆虫学中的应用 的相互区别和新物种的发现。
DNA条形码技术在昆虫学中的应用
在应用昆虫学中的应用
城市昆虫学：关于城市化昆虫的进化起源及其特点已经开始受到越来越多学者
的关注。如通过利用 DNA 条形码对美国47个地点家酸臭蚁样品进行生物地理学研究表明，
每个城市的城市化种群都是由其周围自然环境中的蚂蚁入侵形成的，而非所有的城市化种群 都有一个共同的起源。
(5)目标 DNA 足够的短，便于DNA的提取和PCR的
扩增。
二、昆虫DNA条形码
2、DNA条形码
Herbert 等于 2003 年提出 DNA 条形 码概念（DNA Barcoding） 。利用线粒
体cox1基因（线粒体细胞色素氧化酶亚
基I基因，5'端648 bp）作为通用序列， 建立全球性的物种鉴别系统。
一、昆虫主要的分子鉴定技术
1、分子鉴定技术的必要性
现有物种正以每年约1万种的速度在灭绝， 也亟需一种更加具有效率的生物物种鉴定与 记录体系。 以现在人类社会生产力发展的需求来看， 亟需一种更加具有效率的昆虫物种鉴定体系， 更好地为生产生活服务。
分子鉴定技术能够从不同发育时期的昆
虫标本或残缺的组织中鉴别出物种。
分析，最后得出6 科 180 种的结果。
在昆虫生态学中的应用
确定寄生关系：明确生态系统中种间寄生关系（主要是植食性昆虫与寄主植物 间的关系、 寄生昆虫与寄主的关系等）是生态学研究与昆虫管理中的重要问题 。
Smith等检验了条形码用于研究寄生蝇类的可行性，先用形态方法对哥斯达黎加西北部的关 纳卡斯帝保护区中寄生于鳞翅目幼虫的寄生蝇类进行鉴定，得出 20 个形态种，然后再用 DNA 条形码的方法重新鉴定， 结果不仅区分出了其中17 个具有高度寄主专一性的形态种，