新生牛血清促细胞生长活性检测方法的建立与应用

胞接种于３瓶他５培养瓶中培养４ｄ．如此连续进行
万方数据
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表１ ＰＫｌ５细胞在不同批次新生牛血清下的细胞倍增时间
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见少量死细胞的定位细胞生长判定为＋＋＋＋：细胞生 长呈梭形或星形．胞浆透明．视野内有多个死细胞 的定位细胞生长判定为＋＋＋；细胞形态不均一，胞浆 不透明，胞质内见有多个颗粒或空泡，视野内有较 多死细胞的定位细胞生长判定为＋＋１７１。结果显示，对 照胎牛血清和编号为ＪＮ、ＷＨ、ＬＺ、ＳＤ的新生牛血清 下的细胞生长浓度均可达到并接近１．０ｘ１０６个／ｍＬ， 并且细胞生长均于１２０ｈ左右达到最高峰。细胞生 长状态、峰值前的细胞数、所需时间及记算得的倍 增时间表明，编号为ＪＮ的新生牛血清最接近于对照 胎牛血清，其促细胞生长效应为最好；编号为ＷＨ、 ＬＺ、ＳＤ的新生牛血清的促细胞生长效应一般；编号
造成生物、医学研究及生物制品生产的极大损失。 而且２０００年版《标准》只适用于人用生物制品生产 用牛血清。而对于兽用生物制品、科研用的多种血 清尚无统一的要求。所以，众多应用新生牛血清进 行生产的企业都通过各种筛选方法来选择适合本 企业细胞培养的、质量稳定的血清。 目前，血清质量鉴定方法有定性法（ｒｙｅ等，１９７５）、 定量法（ｒｙｅ等，１９７７）、放射性核苷酸渗入法（Ｄｖｏｒａｋｏｖａ 等，１９８０）、ＭＴＩ＇比色法（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３）吼４１、微量滴
２．０３６ １．８６９ １．６３９ １．４８４ １．５３５ ２．４７８ ２．０６４ １．７４９ １．７６３ １．６３０ １．６６８ ２．６３５ ２．０１９ １．９１２ １．８７３ １．６６９ １．３８８ ２．４７７
细胞孔ＯＤ值
１．８９８ １．７９７ ２．０４１ １．８４２ １．２７９ ２．１２９ １．９４７ ２．１０８ ２．００６ １．６９１ １．２２６ ２．６１６
万方数据
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１．１．３试剂、仪器
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三次传代并计数。每次传代时收获的细胞总数与４ｄ 前种入的细胞数相比较．计算每一代的自身增长率 及相对增长率。自身增长率＝收获时三方瓶的细胞 平均数／种人时三方瓶的细胞平均数×１００％，相对增 长率＝收获时试验血清方瓶内的细胞均数／收获时对 照血清方瓶内细胞均数ｘ１００％ｍ。
细胞相对生长率（％）
细胞工程是现代生物技术的重要组成部分。细 胞培养的发展，培养基的质量是关键．在培养基的 众多组成成分中．动物血清对细胞的生长繁殖发挥 着重要甚至是难以替代的作用。而在动物血清的应 用中牛血清的使用又是最为广泛的。所以牛血清是 医药生物技术产品中重要的原辅材料。做好牛血清 的质量控制是提高生物制品质量的重要环节。为此， ２０００年版《中国生物制品规程》中，首次将牛血清的 质量标准纳入《中国生物制品主要原辅材料质控标 准》，规定了牛血清生产管理和质量控制中需要做到 的八项检查内容。这一措施不仅为牛血清的生产和 使用提供了科学客观的依据，也从源头上加强了生 物制品的质量管理。新生牛血清（简称ＮＢＣＳ）是指 采自出生２４ｈ以内、未吃初乳的健康犊牛之血清。 由于价格上新生牛血清比胎牛血清（ＦＢＳ）要低得多。 并且也足以满足一些常规培养的要求【”，因此在动 物细胞培养中，新生牛血清的应用最为广泛。但由 于血清是一种很复杂的混合物，往往会因受到小牛 产地、个体差异、出生后采血时间以及制备过程中 某些因素的影响，导致各批次间质量的差异很大嘲。
表７
Ｍ，ＩｔＩ＇比色法
ＰＫｌ５细胞在不同批次新生牛血清下三次连续传代培养的细胞生长状况
表８
ＢＨＫ２１细胞在不同批次新生牛血清下三次连续传代培养的细胞生长状况
万方数据
结果见表１０～１２。试验结果与前述各种方法
结果呈现一致性，编号为ＪＮ的新生牛血清促细 胞生长效应为最好；编号为ＷＨ、ＬＺ、ＳＤ的新生牛
表１０ 血清编号 ＪＮ ＷＨ
ＬＺ ｓＤ ＺＺ ２．１ １３ １．９１２ １．９１７ １．５８１ １．３０７ ２．４９０ ２．０５６ ２．０３９ １．８７２ １．７８５ １．３１２ ２．５１１
血清的促细胞生长效应对于不同的细胞呈现不同 的效果：编号ＺＺ的新生牛血清促细胞生长效应 较差。
Ｍ。ｒＴ比色法测定ＰＫｌ５细胞在不同批次新生牛血清下的细胞生长状况 ＯＤ值均数
ＰＫｌ５细胞在不同批次新生牛血清下的细胞克隆生长状况
万方数据
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表５ ＢＨＫ２１细胞在不同批次新生牛血清下的细胞克隆生长状况
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２．３
细胞三次连续传代培养法 结果见表７－９。由于细胞生长速度过快，细胞密
明显比较效果。编号为ＪＮ的新生牛血清最接近于 对照胎牛血清，其促细胞生长效应为最好；编号为 ＷＨ、ＬＺ、ＳＤ的新生牛血清的促细胞生长效应一般； 编号ＺＺ的新生牛血清促细胞生长效应较差。与前述 应用细胞倍增时间测定法所测结果相一致，但应用 ＳＰＳＳｌ７．０统计软件进行分析，发现上述三种细胞的 倍增时间与三次连续传代下的细胞相对增长率无 明显线性相关性（Ｐ＞０．０５）。
２．４
度过大，细胞呈小圆点状密布存在，对照胎牛血清 和部分新生牛血清（如：ＪＮ）生长下的细胞出现多数 死细胞，致使试验结果不具有明显比较效果，但仍 可见血清编号ＺＺ的新生牛血清下的细胞生长状态 差、增殖数量较少。后来在试验设计中将血清含量 降低到６％进行细胞三次连续传代培养，结果表明， ６种血清生长下的细胞生长状态和细胞数量均具有
表４
ｚｚ的新生牛血清促细胞生长效应较差。 ２．２细胞克隆形成率测定法 结果见表４—６。可见编号为ＪＮ的新生牛血清在 三种不同细胞下的细胞相对克隆效率均可达到 ８０％～９０％，且细胞生长状态较好；编号为ＷＨ、ＬＺ、 ＳＤ的新生牛血清在三种不同细胞下的细胞相对克 隆效率次之，促各种细胞生长效应呈现不均一性；编 号ＺＺ的新生牛血清的细胞相对克隆效率在６０％左 右，且细胞生长状态最差。本试验结果与上述三种 细胞倍增时间测定法的结果一致。但应用ＳＰＳＳｌ７．０ 统计软件进行分析．发现上述三种细胞的倍增时间 与其细胞相对克隆无明显线性相关性（Ｐ＞ｏ．０５）。
定法（姜述德，１９８５）以及微量Ｎ一乙酰…１３
Ｄ氨基葡
萄糖苷酶（ＮＡＧ酶）释放法（邵树君，２００１）等［５１。本实 验拟通过对细胞倍增时间测定法、细胞克隆形成率 测定法、细胞三次连续传代培养法、ＭＴＦ比色法以及 微量终点稀释法等多种筛选方法进行比较。以便建 立一种能准确、快速鉴定出新生牛血清促进细胞生 长活性的检测方法。 １材料与方法 １．１材料
１．２ 方法
ＭｒＩ－ＩＩ比色法
试验时每种同一批细胞消化后计数。按５．０ｘ１０４ 个／ｍＬ的细胞浓度接种于９６孔细胞培养板，每孔 １００斗Ｌ，每批血清接种６孔。培养液中含１０％试验新 生牛血清或对照血清，３７℃、５％ＣＯ：条件下培养７２ｈ 后，再加入终浓度为５ｍｇ，ｍＬ的ＭＴＦ ２０斗Ｌ继续培养 ４ｈ，倒出各孔培养液，用１００斗Ｌ ＤＭＳＯ溶解，在振荡 器上振荡１０ｍｉｎ后．置酶联免疫检测仪上于５７０ｎｍ处 测定各孔光吸收值（ＯＤ值），计算出细胞相对生长 率。细胞相对生长率＝（试验血清光吸收值／对照血清 光吸收值）×１００％【４】。 １．２．５微量终点稀释法 试验时每种同一批细胞消化后计数。在９６孔 板各孔中分别加入含１０％试验新生牛血清或对照 血清的细胞培养液１００斗Ｌ。以每横排最后一个孔最 终加入１个细胞计算，按２倍递增计算第１个孔应 加入的细胞个数。即从最后一个孑Ｌ算起，向前依次 为１个、２个、４个、８个、１６个、３２个、６４个、１２８个、 ２５６个、５１２个、１ ０２８个、２ ０５６个细胞，则９６孔板 的第１列的每个孔应各加入２ ０００个细胞左右。分别 用上述细胞培养液将细胞稀释成４ｘｌ＆ｍＬ．在每排第 １孔中加人１００灿Ｌ细胞悬液，与原在孔中的培养液混 匀后取出１００“Ｌ放入第２孔中，再与第２孔中的培 养基混匀后取出１００斗Ｌ加入第３个孔中，依此倍比 稀释直至最后一孔，再从最后一孔中取出１００斗Ｌ细 胞悬液弃掉。每批血清样品用２横排孔作平行孔。 将培养板置３７℃、５％ＣＯ：培养箱中培养７ｄ。培养结 束后取出９６孔板，倒置显微镜下观察比较在同一细 胞浓度下不同血清的细胞生长状况，一般将稀释倍 数较高的细胞作为主要观察对象。 ２结果与分析 ２．１细胞倍增时间测定法 结果见表ｌ～３。细胞分裂时呈梭形或星形，胞质 向外伸出多个长短不一的突起，细胞透明，一个视野
１．２．４
ＤＭＥＭ干粉培养基（Ｇｉｂｃｏ），睨５一次性细胞培
养瓶和９６孔细胞培养板（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ），四甲基偶 氮唑盐（ＭＴｒ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ），０．１％胰 酶一ＥＤＴＡ混合消化液和无钙镁Ｈａｎｋ’ｓ液（本实验 室，ｐＨ７．２），ＸＤＳ一１Ｂ倒置显微镜（重光Ｃｏｉｃ），Ｃ０２培 养箱（ＳＡＮＹＯ），微量移液器（ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ），全自动酶 标仪（ＢｉｏＴｅｋ Ｅｋ８００），百级层流罩（本实验室）。
１．１．１
细胞株 ＰＫｌ５细胞、ＢＨＫ２１细胞和ＳＴ细胞均为本研究
院保存。 收稿日期：２０１０—１２—２８
作者简介：庄金秋（１９７８一），女，山东潍坊人。在职兽医硕士。助理研
究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。 通讯作者：沈志强。
１．１．２血清 对照胎牛血清（Ｂｏｖｏｇｅｎ）和５种新生牛血清（编 号为ＷＨ、ＬＺ、ＪＮ、ＺＺ和ＳＤ）。
１．２．１细胞倍增时间测定法 试验时每种同一批细胞消化后计数，按 １．Ｏｘｌ０４个，ｍＬ的细胞浓度接种于９６孑Ｌ细胞培养板。 每孔１００恤Ｌ，每批血清接种８孔。培养液中含１０％ 试验新生牛血清或对照血清，３７℃、５％Ｃ０２条件下 培养，每２４ｈ计数１孔细胞，连续观察７ｄ【司。绘制细 胞生长曲线。并计算细胞倍增时间。细胞生长曲线的 最高峰值即血清促进细胞生长的最大增殖量。细胞 倍增时间的测定：取细胞峰值前ｌｄ计得数（Ｙ）、接种 细胞数（Ｘ）及细胞生长时间（Ｔ）计算倍增时间。细胞 倍增时间＝Ｔ／Ａ，Ａ＝ｌ０９２Ｙ／）（ｍ。 １．２．２细胞克隆形成率测定法 试验时每种同一批细胞按有限稀释法做克隆 培养，调整细胞浓度为５０个，ｍＬ和１０个／ｍＬ，接种 于９６孔细胞培养板中，每孔１００斗Ｌ，每批血清使用 ８个孔，培养液中含１０％试验新生牛血清或对照血清， ３７℃、５％ＣＯ：条件下培养１０ｄ后，在倒置显微镜下观 察细胞状态，并计下每个孔的克隆细胞数，计算出 相对克隆率。细胞克隆效率＝阳性孔细胞平均数／培 养孔总数ｘ１００％．相对克隆效率＝试验血清克隆效率， 对照血清克隆效率×１００％【４】。
１．２．３
细胞三次连续传代培养法 试验时每种同一批细胞以每瓶１．０ｘ１０５个的细
Hale Waihona Puke Baidu
胞数接种于Ｔ２５培养瓶中。他５培养瓶中的培养液
总体积固定为５ｍＬ。其中含１０％试验新生牛血清或 对照血清，每批血清使用３个－Ｉ＇２５培养瓶平行地密 闭培养。所有培养物于３７℃、５％ＣＯ：培养箱中培养 ４ｄ后，先用无钙镁Ｈａｎｋ’ｓ液将培养物洗三遍，以消 除血清的影响。然后定量地加入０．１％胰酶一ＥＤＴＡ消 化液进行消化。细胞计数后，又以每瓶１．０ｘ１０５个细
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新生牛血清促细胞生长活性检测方法的建立与应用
庄金秋。梅建国，管字，苗立中，沈志强
：兰！：
（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州
２５６６００）
中图分类号：￥８２３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－－４２６４（２０１１）０６—００３１—０６
摘要：牛血清是医药生物技术产品中重要的原辅材料之一。做好牛血清的质量控制是提高生物制品质量的重 要环节。本研究通过应用ＰＫｌ５、ＢＨＫ２１和ＳＴ三种兽用生物制品研制中常用的细胞作为载体。选用国内同等 价位５个不同厂家生产的新生牛血清作为比较对象，采用细胞倍增时间测定法、细胞克隆形成率测定法、细 胞三次连续传代培养法、ＭｒＩ－Ｉ＇比色法和微量终点稀释法五种血清质量鉴定的方法进行比较，检测新生牛血 清的促细胞生长活性。最终确定了ＭｒＩ－Ｉ＇比色法作为便捷高效快速筛选新生牛血清的检测方法。 关键词：新生牛血清；细胞倍增时间；四甲基偶氮唑盐比色法（ＭＴＴ）；检测方法