精氨酸激酶的表达及纯化解析

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

生物学实验教学中心

目录

引言 (4)

1实验材料、试剂、仪器 (7)

2 实验方法 (9)

2.1配制LB液体培养基 (9)

2.2 活化菌种 (9)

2.3 扩大培养 (9)

2.4 IPTG诱导AK的表达 (9)

2.5蛋白质提取 (9)

2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (10)

2.7 上样和洗脱 (10)

2.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度 (10)

3 结果与分析 (11)

3.1层析谱图 (11)

3.2 SDS-PAGE电泳带型分析 (12)

总结 (13)

参考文献 (14)

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

指导老师：

摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml

的卡纳霉素的LB培养基中培养。当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM

的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。加裂解液后用超声破

壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。通过CM-Cellulose阳离子交换层析，

SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电

泳纯的精氨酸激酶。

关键词：精氨酸激酶表达与纯化

Expression and Purification of Arginine Kinase

Abstract：Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which

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contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/m L). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchange chromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.

Key words: arginine kinase expression and purification

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

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引言

无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK 在体内催化反应方程式如下：

Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphate

AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。

虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK 在结构上表现出了非常大的多样性。按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。

某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕[2]。过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部[3]。如下图所示[4]：

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图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构

我们已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。

在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达。当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达[5]。IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备

亲和层析法

依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。

当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。特异结合在基质上的靶蛋白

最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯

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