基因工程目的基因的获取

二、 化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区 域，不同片断之间的互补区域能形成有断 点的完整双链。
（2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带
上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
要求：1、已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb
3. 基因文库构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
2. 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
第三节 PCR扩增获得目的基因
以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接
② 平端连接
③同聚物加尾连接
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
染色体
PCR 可以把 指定的基因片段 数Байду номын сангаас放大
第四节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因
一、基因文库的构建
1. 基因文库（gene library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保 存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有 了该生物体的全部基因，因此，称之为基因 组文库（genomic library）或基因文库（gene library）。
④人工接头法（adapter）
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
制
酶
G CCTAG
GATCC G
切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DNA文 库获取目的基因
基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克 隆载体所携带的所有基 因组DNA的集合
2. 构建基因文库的载体选用
载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构 建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
目的基因的获取
化学合成法 直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应
基因组DNA文库;cDNA文 库
第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。
带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③ 用酸或碱的脱保护
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2.亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连 接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去， 所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的， 具体的合成和延伸过程如图。
（2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
（3）DNA溶液小孔喷射
注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右 的片段。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。