基因工程目的基因的获取
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因工程主要流程
基因工程主要流程基因工程呀，那可老有趣啦。
基因工程的流程呢，有这么几个主要的部分。
一、目的基因的获取。
咱得先把想要的那个基因弄到手呀。
这就好比咱要做菜，得先把食材找着。
那怎么找这个目的基因呢？有好几种办法呢。
一种是从基因文库里面去淘。
基因文库就像是一个大仓库，里面存着各种各样的基因片段，咱就在这里面翻翻找找，看看能不能发现咱需要的那个基因。
还有一种办法是通过化学合成，如果这个基因的序列咱已经知道得很清楚了，那就像按照食谱做菜一样，咱可以人工把这个基因合成出来。
另外呀，要是知道这个基因在哪个生物体里，还可以用PCR技术，这个技术就像是一个精准的小助手，能把我们要的基因从生物体的基因组里给大量复制出来，这样我们就有足够的基因来进行后面的操作啦。
二、基因表达载体的构建。
有了目的基因之后呢，咱不能就这么直接把它放到受体细胞里呀，得给它造个小房子，也就是构建基因表达载体。
这个载体就像是一个小飞船，带着目的基因进入受体细胞。
这个载体里面呢，除了有目的基因，还有启动子、终止子这些重要的部件。
启动子就像是发动机的开关，它能让基因在受体细胞里开始表达，要是没有这个启动子，基因就像一辆没钥匙的汽车，发动不了。
终止子呢，就像是刹车，让基因的表达在合适的时候停下来。
而且呀，这个载体上通常还会有标记基因，这标记基因可有用啦，就像是给这个小飞船做个记号。
比如说我们用抗某种抗生素的基因做标记基因，那把这个构建好的载体放到含有这种抗生素的培养基里，能长起来的细胞就是成功导入了载体的细胞，就像在一群小朋友里，带着小红花的就是表现好的一样。
三、将目的基因导入受体细胞。
接下来就是把带着目的基因的载体送到受体细胞里去。
这个过程就像是送快递一样。
对于不同的受体细胞，送的方法还不一样呢。
如果受体细胞是植物细胞，我们可以用农杆菌转化法。
农杆菌就像是一个小邮差，它能自然地把我们构建好的载体送到植物细胞里面去。
还有基因枪法，就像用枪把基因载体像子弹一样打到植物细胞里。
论述基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤基因工程，也称为遗传工程，是一种对生物的遗传物质进行操作和改造的技术。
通过基因工程，科学家可以精确地修改生物体的基因，从而创造出具有特定性状的生物体。
以下是基因工程的基本步骤：1. 目的基因的获取：首先，研究人员需要确定他们想要修改的特定基因。
这些基因可能是与某种特定性状或疾病有关的基因。
然后，他们使用不同的方法，如反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、基因文库筛选或者基因组测序等，来获取这些基因的DNA片段。
2. 基因载体的选择与构建：基因载体是一种能够将目的基因带入细胞内的分子。
常见的基因载体有质粒和病毒。
构建基因载体时，需要在载体上加入特定的标记基因，以便在目的基因成功导入细胞后进行筛选。
3. 目的基因与载体的连接：这一步被称为“重组”，是基因工程的核心步骤之一。
在这一步中，研究人员使用限制性核酸内切酶（限制酶）将目的基因和载体切开，然后利用DNA 连接酶将目的基因和载体重新连接在一起。
4. 将目的基因导入受体细胞：此步骤是将重组后的DNA分子导入到宿主细胞中。
这个过程通常需要使用一种称为“转化”或“转染”的方法来完成。
5. 目的基因的检测与鉴定：这是最后一个步骤，涉及到对已经导入受体细胞的DNA进行检测和鉴定。
研究人员通常会使用特定的技术和方法，如聚合酶链式反应（PCR）扩增、DNA测序、限制性酶切分析和荧光原位杂交等，来验证目的基因是否成功导入受体细胞，以及目的基因是否表达。
以上就是基因工程的基本步骤。
需要注意的是，这些步骤并不是一次完成的，往往需要反复进行，并对结果进行评估和优化。
同时，这些步骤都需要严格遵守伦理和法律规范，以确保研究人员的安全以及保护被研究生物的权益。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法目的基因的获取方法是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因的定位、克隆、转染等一系列操作。
在进行目的基因获取时，科学家们需要遵循一定的步骤和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
下面将介绍一些常用的目的基因获取方法。
首先，基因定位是获取目的基因的第一步。
通过PCR、Southern blotting等技术，科学家们可以准确地定位到目的基因在细胞或生物体中的位置，为后续的克隆和转染奠定基础。
其次，基因克隆是目的基因获取的关键步骤。
科学家们可以利用质粒、原核生物或酵母等载体系统，将目的基因从细胞或生物体中克隆出来。
这一过程需要利用限制性内切酶、连接酶等酶切和连接技术，以确保目的基因的完整性和准确性。
接着，目的基因的转染是获取目的基因的另一重要步骤。
科学家们可以利用质粒转染、病毒载体转染等技术，将目的基因导入到细胞或生物体中，实现其稳定表达和功能研究。
此外，目的基因的获取还可以通过基因编辑技术实现。
CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN等基因编辑技术可以精准地编辑基因组，实现目的基因的定点修饰和获取。
最后，为了确保目的基因的稳定性和可控性，科学家们还需要进行基因的筛选和鉴定。
通过PCR、Western blotting、荧光染色等技术，科学家们可以对目的基因进行筛选和鉴定，确保其在细胞或生物体中的准确表达和功能发挥。
总之，目的基因的获取是基因工程研究中的重要一环，它涉及到基因定位、克隆、转染、编辑、筛选和鉴定等一系列技术和步骤。
科学家们需要结合实际研究需求和具体操作，选择合适的方法和技术，以确保目的基因的准确获取和稳定表达。
希望本文介绍的方法能够对相关研究工作提供一定的参考和帮助。
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法
目的基因的获取方法是基因工程领域中的重要步骤，它是指从生物体中获取特
定的基因序列的技术和方法。
目的基因的获取是进行基因克隆、基因表达和功能研究的前提和基础，因此对目的基因的获取方法进行深入了解和掌握对于基因工程研究具有重要意义。
首先，目的基因的获取方法可以通过PCR技术实现。
PCR是聚合酶链式反应
的缩写，它是一种能够在体外扩增DNA片段的技术。
通过PCR技术，可以利用引物将目的基因从生物体中扩增出来，然后进行纯化和测序，最终获取到目的基因的序列信息。
其次，目的基因的获取方法还可以通过基因文库筛选实现。
基因文库是将生物
体中的DNA片段进行分离、纯化并进行存储的库，研究者可以通过筛选基因文库
中的目的基因序列，然后进行克隆和表达，最终获取到目的基因的信息。
此外，利用基因克隆技术也可以实现目的基因的获取。
基因克隆是指将目的基
因从生物体中进行分离、纯化，并将其插入到载体中，然后通过转化等技术手段获得目的基因的方法。
最后，目的基因的获取方法还可以通过合成基因实现。
合成基因是指利用化学
合成的方法，根据目的基因的序列信息进行人工合成，然后进行表达和功能研究。
综上所述，目的基因的获取方法有多种途径，包括PCR技术、基因文库筛选、基因克隆和合成基因等。
研究者可以根据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法进行目的基因的获取，从而为基因工程研究提供有力支持。
基因工程中筛选目的基因的方法
基因工程中筛选目的基因的方法1. 核酸杂交筛选法！就像在茫茫人海中找到那个与你契合的灵魂伴侣一样，通过核酸杂交这个神奇的手段，能精准地找到我们想要的目的基因呢！比如我们想找一个特定的基因来治疗疾病，就可以用这个方法去把它揪出来。
2. 基因文库筛选法呀！这就好比是一个超级大的基因宝库，你可以在里面尽情地寻找你需要的宝藏——目的基因。
想象一下，在无数的基因中找到那个关键的它，多刺激呀！比如在寻找提高农作物产量的基因时，就可以利用这个方法嘞。
3. PCR 筛选法呢，哇塞，这可厉害了！简直就像拿着一个超级放大镜，一下子就能把目的基因给找出来。
比如说我们在研究一种新型病毒时，利用PCR 就能快速找到相关的目的基因啦。
4. 免疫筛选法，嘿嘿，就像是身体的免疫系统能精准识别敌人一样，通过免疫反应来找到特定的目的基因哟！例如要找一个用于生产抗体药物的基因，免疫筛选法就派上大用场啦。
5. 酶切筛选法呀，这就像是一个精准的剪刀，能把不符合要求的基因剪掉，留下我们想要的目的基因呢！打个比方，在改造某个生物特性时，就可以用这个方法来筛选基因啦。
6. 噬菌体展示筛选法，这可太有意思啦！就如同在一个热闹的基因集市上，让目的基因自己展示出来，然后我们轻松地把它挑出来。
比如要筛选出能特异性结合某种物质的基因，这不就正好可以用这个方法嘛。
7. 酵母双杂交筛选法，哇哦，这就像一个巧妙的牵线搭桥，能找到相互作用的目的基因呢！像探索蛋白质之间的关系时就能用它来找关键基因啦。
8. 基因芯片筛选法，好厉害的感觉哟！如同有一张超级基因地图，一下子就能锁定目的基因的位置。
好比在大规模基因分析中，这个方法就超有用的啦！总之，这些方法就像是一把把钥匙，能帮我们打开基因奥秘的大门，真的超级神奇啊！。
基因工程操作步骤
4.目的基因的检测与鉴定 在受体细胞中稳定遗传和正 确表达。
一、目的基因的获取
1 目的基因主要是编码蛋白质的基因： 如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相 关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、 与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的 基因、具调控作用的因子等。
合成
热稳定的DNA聚合酶
特点
半保留复制、 边解旋变复制
半保留复制、 全解旋再复制
结果
形成整个DNA分子
大量的DNA片段
随堂闯关 PCR技术扩增过程
a、DNA变性（90℃-95℃）: 双链DNA模板 在热作用下， 氢断键裂，形成____单__链_
b、复性（55℃-60℃）: 系统温度D降N低A ，引物 与DNA模板结合，形成局部__双__链____。
③例: 转基因抗虫棉
2.将目的基因导入动物细胞
①方法: 显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯
显微注射
受精卵
取卵（受精卵） 新性状动物
3.将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因:
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌: 大肠杆菌
③常用法: Ca2+处理获得感受态细胞
④过程:
Ca2+处理 大肠杆菌
1.2 基因工程的基本操作程序
知识回顾: 基因工程基本操作的四个步骤
有了目的基因, 我们才能赋予
1.目的基因的获取 一种生物以另一种生物的遗 传特性。
使目的基因在受体细胞中稳
2.基因表达载体的构建 定存在, 并可进行遗传、表达 和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达,
3.目的基因导入受体细胞 才能实现一种生物的基因在 另一种生物中的转化。
基因工程基本操作的四个步骤
利用PCR技术扩增
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。
在PCR反应中，模板DNA、引物、四种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶以及适宜 的缓冲液系统被置于“热循环”的反应环境中，通过精确控制温度，在DNA聚合 酶作用下高特异性、高灵敏度地扩增目的基因。
受体细胞的选择
01
02
03
原核细胞
适用于细菌等原核生物作 为受体细胞，如大肠杆菌。
真核细胞
适用于动物和植物细胞作 为受体细胞，如CHO细胞、 动物胚胎细胞、植物愈伤 组织等。
受精卵
适用于动物基因工程，直 接将目的基因导入受精卵， 实现基因的长期稳定表达。
转化或转染方法
01
02
03
04
化学转化法
利用CaCl2、MgCl2等化 学试剂诱导细菌感受态 细胞的产生，吸收外源 DNA。
载体的构建过程
目的基因的获取和修饰
从供体细胞中获取目的基因，并进行 必要的修饰，如限制性酶切、连接等。
载体的获取和修饰
从宿主细胞中获取载体，并进行必要 的修饰，如限制性酶切、连接等。
目的基因与载体的连接
将目的基因与载体进行连接，形成重 组DNA分子。
重组DNA分子的转化
将重组DNA分子导入到宿主细胞中， 并使其在宿主细胞中复制和表达。
03 目的基因与载体的连接
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸 序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸
之间的磷酸二酯键进行切割的酶。
限制性核酸内切酶的识别位点通常是DNA双链上的特 异序列，这种序列通常由4-6个核苷酸组成。
基因工程 第五章目的基因的获取
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。
目的基因的4种获取方法
目的基因的4种获取方法目的基因的4种获取方法目的基因是指科学家们在研究某种生物学现象时，所需要的特定基因。
获取目的基因是进行分子生物学研究和基因工程实验的前提条件之一。
本文将介绍四种常见的获取目的基因的方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是一种常见且简便的获取目的基因方法。
其原理是利用DNA聚合酶在模板DNA上进行反复扩增，从而获得大量目标序列。
PCR扩增法适用于已知序列或有已知序列片段可供引物设计的情况下。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. PCR反应：将引物与模板DNA加入PCR反应体系，通过多轮温度循环反复扩增出目标序列。
4. 纯化PCR产物：通过凝胶电泳等手段纯化出PCR产物。
二、限制性内切酶消化法限制性内切酶消化法是一种利用限制性内切酶切割DNA，从而获得目标序列的方法。
其原理是在DNA双链中寻找特定的核苷酸序列，并将其切割成特定长度的DNA片段。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
3. 选择限制性内切酶：根据目标序列中存在的限制性内切酶位点，选择合适的限制性内切酶。
4. 消化反应：将模板DNA与选择好的限制性内切酶加入反应体系，进行消化反应。
5. 纯化产物：通过凝胶电泳等手段纯化出所需长度的DNA片段。
三、基因克隆法基因克隆法是一种将外源基因插入到载体中并进行繁殖复制的方法。
其原理是通过PCR扩增或限制性内切酶消化等手段获取目标基因，并将其插入到载体中，再通过细胞培养等手段进行繁殖复制。
具体步骤如下：1. 设计引物：根据目标序列设计出适当长度、互补性良好、不含二级结构和非特异性引物。
2. 提取模板DNA：从样品中提取出含有目标序列DNA片段的模板。
基因工程六大步骤
基因工程六大步骤嘿，你知道基因工程吗？这可是个超级神奇的领域，就像在生命的密码本上做修改一样。
今天我就来给你讲讲基因工程里的六大步骤，可有趣了呢。
第一步：目的基因的获取。
这就像是在一个巨大的宝藏库里找一颗特定的宝石。
我们要从生物的基因组里把我们想要的那个基因找出来。
怎么找呢？有好多办法呢。
比如说从基因文库里筛选，这就好比在一个装满各种书（基因）的大图书馆里找一本特定书名（目的基因）的书。
有时候我们还可以通过化学合成的方法，如果这个基因比较小的话，就像自己动手做一个小零件一样。
我有个朋友在做这个工作的时候，整天就对着那些基因序列，眼睛都看花了，还嘟囔着：“哎呀，这就像大海捞针啊，不过我一定要把你找出来！”这一步可不容易，得特别细心，不然找错了基因，后面可就全乱套了。
第二步：基因表达载体的构建。
这一步啊，就像是给我们找到的宝石（目的基因）打造一个专属的盒子，让它能够在新的环境里发挥作用。
我们得把目的基因和一些其他的元件组合在一起，像启动子、终止子之类的。
启动子就像是发动机的开关，它能让基因开始表达。
终止子呢，就像刹车，让表达在合适的时候停下来。
我曾经看到实验室里的小伙伴们在构建载体的时候，那专注的神情，就好像在打造一件绝世珍宝一样。
他们一边操作一边说：“这可得小心点儿，每一个元件都得放对位置，不然这个‘小机器’可运转不起来啊。
”这一步需要很多的技术和经验，就像盖房子一样，一块砖放错了位置，可能整座房子都不稳固了。
第三步：将目的基因导入受体细胞。
这可就像把我们包装好的“宝物”送到一个新的地方去。
受体细胞有很多种选择，像细菌细胞、植物细胞或者动物细胞。
导入的方法也不一样。
比如说把基因导入细菌细胞的时候，我们可以用转化的方法，就像给细菌细胞开个小后门，让基因偷偷溜进去。
要是导入植物细胞呢，有时候可以用农杆菌转化法，这农杆菌就像是一个小快递员，把我们的目的基因送到植物细胞里。
我记得有次在讨论这个步骤的时候，一个同学就问：“这就像把一个陌生人送到一个新的社区，细胞会接受这个外来的基因吗？”这确实是个问题，不过只要方法得当，还是很有希望成功的。
目的基因的获得
（2）、从染色体以外的遗传物质中 获得目的基因是常用的做法
方法二、化学合成法
人工合成寡聚核苷酸技术：<60bp 在60bp与120bp之间
1.2元/bp 6.8元/bp
提供DNA合成服务的公司： 上海生工生物工程有限公司 上海英俊生物科技有限公司 上海华诺生物科技有限公司 北京奥科生物技术有限责任公司 等
特点： 1、 合成的产物是单链DNA
2、 5’、3’末端均为羟基
3、应用场合： 真核生物基因在原核中表达； 难以得到模板的情况；
获得双链的方法：
（1）、3’末端部分反向互补，混 合后在DNA聚合酶作用下互为模 板形成双链
（2）分段合成法 OH，先用激酶处理，使磷酸化
OH，先用激酶处理，使磷酸化
连接酶
（3）、分段合成，结合PCR技术 PCR
方法三、PCR技术 （1）、直接从原核微生物细胞或质粒 中扩增目的片段
（2）、引入突变
a、引物5’端引入 b、定点突变，SOE技术 c、易错PCR
方法四、RT-PCR技术
针对真核生物基因不连续的特点，利用mRNA为核 苷酸信息资源，用逆转录---PCR法获得目的基因
5’
AAA…AAA 3’
T T T…T T T
Complimentary DNA
RT：Reverse Transcriptase
Summary: 1、细胞中提取； 2、化学合成； 3、PCR技术； 4、RT-PCR
前言
基因工程技术又称为重组DNA技术， 指将某些特定的基因或DNA片断，通过载 体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。
目前用基因工程生产的蛋白质药物已达数十种，许多以前 本不可能大量生产的生长因子，凝血因子等蛋白质药物， 现在用基因工程办法便可能大量生产。
基因工程获取目的基因的方法
基因工程获取目的基因的方法1. 基因工程的简单介绍基因工程，这个听起来有点高大上的词，其实就像是在改造一个玩具，让它变得更好、更酷。
说白了，就是人类学会了如何操控基因这把“钥匙”，让我们可以“开锁”到各种各样的生物特性。
想象一下，科学家们就像是小孩子在玩拼图，他们把不同的基因拼接在一起，想要创造出全新的“图案”。
这可不只是好玩，还是对医疗、农业等领域的重大贡献呢！那么，如何获取这些“拼图块”呢？这就需要一些技巧了。
我们可以用不同的方法把目标基因从大自然中找出来，或者是从细胞里“偷”出来。
别着急，接下来就带大家看看这几种常见的方法。
2. 常用的方法2.1 PCR技术首先，要提到的就是PCR技术。
PCR就像是基因的复印机，能把你需要的基因快速“复制”出来。
这一过程其实并不复杂，只需几个步骤：首先，科学家们要准备好一段DNA链，就像准备好一张需要复印的纸。
接着，添加一些特定的酶和引物，这些小家伙就像是复印机的墨水和纸张，没了它们，复印机可就没法工作了。
然后，通过加热和降温的循环，DNA就会不断地“翻倍”，仿佛在开Party一样，越来越多的人涌进来。
最后，经过几个小时的“忙碌”，你就能得到大量的目标基因！听起来简单吧？当然，实际操作中还有很多细节需要注意，不然就会像做菜时放盐放多了，味道就变了。
2.2 基因克隆接下来是基因克隆，这是一种更为传统的获取目标基因的方法。
想象一下，你的家里有一盆漂亮的花，你希望能有更多的相同花。
于是你从花的根部剪下一个小枝条，插到土里，就能长出一模一样的花。
这就是克隆的基本原理。
在实验室里，科学家们会从细胞中提取目标基因，然后把它放进一个细菌或酵母的载体中。
这就好比给这个小细菌一个“任务”，让它去生产出更多的目标基因。
只需耐心等待，经过一段时间，小细菌们就会疯狂地繁殖，结果就是，你可以收获一大堆的目标基因。
2.3 CRISPR技术最后，咱们要聊聊时下最火的CRISPR技术。
CRISPR听起来像是科幻电影里的名词，但其实它是一种革命性的基因编辑工具。
基因工程目的基因获得的方法
基因工程目的基因获得的方法1. 引言基因工程是一种通过改变生物体的基因组来实现特定目的的科学技术。
基因工程的目的包括但不限于改善农作物品质、开发新药物、治疗遗传性疾病等。
在基因工程中，获得目的基因是关键步骤之一，本文将介绍几种常用的方法来获取目的基因。
2. 目的基因获得方法2.1 基因克隆基因克隆是最常用且经典的获得目的基因的方法之一。
该方法利用DNA重组技术，将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA。
通过转化等手段将重组DNA导入宿主细胞中，使其复制和表达。
具体步骤如下：2.1.1 DNA片段获取首先需要从源生物体中获取所需DNA片段。
可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割、合成等方式获得。
2.1.2 载体构建选择适当的载体，如质粒或噬菌体，并进行线性化处理。
然后将待克隆的DNA片段与载体进行连接，形成重组DNA。
2.1.3 转化将重组DNA导入宿主细胞中。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法、化学法等。
转化后，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆。
2.2 基因合成基因合成是一种直接合成目的基因序列的方法。
该方法适用于无法通过其他方式获取目的基因序列的情况，或者需要对基因序列进行修改和优化时使用。
具体步骤如下：2.2.1 设计和优化根据所需功能和特定要求，设计目标基因序列。
可以根据已有序列进行修改和优化，如引入特定限制性内切酶切位点、调整密码子使用频率等。
2.2.2 合成将设计好的目标基因序列提交给合成公司进行合成。
合成公司通常采用化学方法或PCR扩增方法来合成目标基因。
2.2.3 克隆将合成好的目标基因插入到载体中，并进行转化过程，获得含有目的基因的克隆。
2.3 基因编辑基因编辑是一种通过直接修改生物体基因组来实现目的基因获取的方法。
常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFN等。
具体步骤如下：2.3.1 设计和构建编辑工具根据目的基因序列，设计适当的编辑工具。
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。
这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。
2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。
这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。
3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。
然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。
4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。
这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。
5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。
这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。
获取目的基因的方法
获取目的基因的方法目的基因的获取是分子生物学和遗传工程领域中的一项重要任务，它对于研究基因功能、调控基因表达以及基因治疗等方面具有重要意义。
在目的基因的获取过程中，需要采取一系列的方法和技术来实现。
本文将介绍几种常见的获取目的基因的方法。
1. PCR扩增法。
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的基因扩增技术，可以在体外迅速扩增目的基因。
通过设计引物，PCR可以选择性地扩增目的基因序列，而不会扩增其他非目的基因。
这项技术具有高效、快速、准确的特点，是获取目的基因的常用方法之一。
2. 基因克隆法。
基因克隆是通过将目的基因插入载体，再将载体导入宿主细胞，实现目的基因的获取。
常见的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。
通过限制性内切酶切割目的基因和载体，再经过连接酶的作用，将目的基因插入载体中。
这项技术可以获取大片段的基因序列，适用于基因工程领域的研究。
3. 基因合成法。
随着合成生物学的发展，基因合成技术已经成熟，可以通过化学合成的方式获取目的基因。
科学家可以根据目的基因的序列设计引物，将核苷酸逐一合成，再将它们连接成完整的基因序列。
这项技术可以合成人工序列的基因，对于研究基因功能和构建人工基因组具有重要意义。
4. 基因组编辑法。
基因组编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，已经成为获取目的基因的重要手段。
通过设计特定的引导RNA，CRISPR-Cas9系统可以精准地切割基因组中的目的基因，实现基因的敲除、插入或修饰。
这项技术具有高效、精准的特点，对于研究基因功能和基因治疗具有重要意义。
总结。
获取目的基因的方法多种多样，每种方法都有其适用的场景和特点。
在实际研究中，科学家可以根据研究目的和实验条件选择合适的方法来获取目的基因。
随着生物技术的不断发展，相信未来会有更多更高效的方法出现，为基因研究和应用提供更多可能性。
基因工程的四个步骤高中生物
基因工程的四个步骤可以简述为以下四步：
1. 目的基因的获取：从基因文库中获取或利用PCR技术扩增基因组DNA。
2. 基因表达载体的构建：基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
3. 受体细胞的选择和培养：根据基因工程的需要，选择适当的受体细胞并进行培养。
4. 基因的转化：将目的基因导入受体细胞。
这四个步骤在高中生物中的具体应用和解释如下：
1. 目的基因的获取：目的基因是从基因库或实验室设计合成，而PCR技术扩增基因组DNA 使得获取目的基因更加便捷。
例如，对于某个特定的生物性状，可以通过分析已知的基因序列来合成目的基因。
2. 基因表达载体的构建：这是将目的基因与合适的启动子、终止子和标记基因等调控组件重组在一起的过程。
这确保了目的基因能在细胞内以特定的方式表达，从而产生所需要的蛋白质。
3. 受体细胞的选择和培养：受体细胞可以是植物细胞、动物细胞或微生物细胞。
高中生物中可能涉及到植物组织培养的内容，就是利用基因工程技术培养符合要求的新植物个体。
4. 基因的转化：这一步是通过某种转化技术，如电转化、显微注射等方法，将重组的表达载体导入受体细胞。
这一步的关键在于确保表达载体准确无误地进入细胞，并且能够在细胞内正常运作。
以上就是基因工程的四个步骤在高中生物中的具体应用和解释。
总的来说，这些步骤体现了现代生物技术的核心内容，即通过改变遗传物质来创造新的生物或修改现有生物的特性。
这些技术不仅在科学研究中具有重要价值，也在工农业生产、医药卫生等领域有着广泛的应用前景。
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组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN有基人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或 衔接物（Linker）序列。
EcoRI Adaptor EcoRI Linker
DNA合成仪
第三节 PCR扩增获得目的基因
以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
第五章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
目的基因的获取
化学合成法 直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应基因组DNA;cDNA文 库第一节 基因组DNA片段化
一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同 大小的片断。
2. 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以 相互作为另一个片断延长的引物，用DNA 聚合酶延伸成完整的双链。
5’
3’
Klenow片段 引物
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。
染色体
PCR 可以把 指定的种生物细胞的整个基因组DNA切割 成大小合适的片断，并将所有这些片断都与 适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保 存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有 了2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
（3）DNA溶液小孔喷射
注射器法可将100kb以上的DNA剪切成10 kb左右 的片段。
第二节 化学合成目的基因
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法 合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
④人工接头法（adapter）
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应制酶G CCTGGATCC G切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一 个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③ 用酸或碱的脱保护
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2.亚磷酸三酯法
原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连 接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去， 所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的， 具体的合成和延伸过程如图。
酶切
1. 优点
由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
2. 缺点
目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化
1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数
二、 化学合成DNA片断的组装
化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 1. 互补连接法
（1）互补配对
预先设计合成的片断之间都有互补区 域，不同片断之间的互补区域能形成有断 点的完整双链。
（2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带
上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链 T4多核苷酸激酶 使5’-OH磷酸化 T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
影响所切出的产物的长度和随机程度。
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法
（1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
① 物理切割法：
超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到 10-30kb的随机片断。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接
② 平端连接
③同聚物加尾连接
要求：1、已知目的基因的核苷酸序列 或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
* 化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列
一、目前常用的方法
磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接