生物工程综合实验指导书

生物工程综合实验（一）实验指导书

编写人蒋雪薇盛灿梅

长沙理工大学

化学与生物工程学院

二０一六年九月

实验项目二名称：YSCP的发酵实验

实验项目性质：综合型实验

实验计划学时：1周

实验分组：响应面设计每班8个试验号，每个试验号7～8人；发酵罐试验分4大组。

一、实验目的：

1、学习并掌握小型自控发酵罐的构造及培养基的罐内灭菌方法；

2、学习菌体量的测定方法及菌体生长动力学方程的计算机归纳方法；

3、设计YSCP发酵条件优化试验并实施，掌握试验数据的处理方法

4、掌握YSCP液体深层发酵方法及发酵过程动态特性的检测

二、实验原理：

1、小型自控发酵罐的构造及培养基的灭菌

（1）小型自控发酵罐的构造

小型自控罐是带搅拌的夹套式加热的各种规格的生物反应器，是基于工业以太网控制技术的生物发酵成套系统。该装置采用专用微型计算机控制系统，功能齐全，操作简便，但结构原理相对比较复杂。能适用于微生物菌种的制备，各类发酵过程的研究开发等。

主要构造：

罐体：316L不锈钢。

专用取样阀：316L不锈钢，可微量取样、可反复彻底灭菌。

控温系统：PID控制，夹套内中采用新型导流结构，可避免流体短路造成冷热不均。

通气系统：不锈钢管道配合卡套式接头。

不锈钢罐架：不锈钢框架结构。

下位机控制箱：基于工业以太网的智能控制器；工业以太网和485、232等通讯接口；10个A/D输入口；4个D/A输出口；11个开关量输入输出口；搅拌温度调速板；4个蠕动泵；功率输出控制板；1个温度、2个液位、pH、和溶氧（DO）等信号的变送器。

传感器：1个温度pt100铂电阻、2个液位电极、pH电极、和溶氧（DO）电极等，并有转子流量计。

（2）灭菌

全自动发酵系统采用就地蒸汽灭菌，所需蒸汽压力应在0.2Mpa~0.3Mpa。蒸汽用量为

20公斤/时。系统的灭菌包括发酵罐培养基的灭菌，空气过滤器及空气管道的灭菌，以及取样阀的灭菌。为保证培养液的浓度，一般采用夹套间接蒸汽灭菌。

2、微生物培养过程的增殖曲线也称生长曲线，即从接种到培养结束，细胞数量的变化曲线。每个菌种的增殖曲线并不相同，但其规律是一致的，一般分为迟滞期、加速期、对数期、减速期、恒定期及衰亡期。其中前4个时期是最为重要的（在菌种扩培中）。YSCP培养中，菌体收获量是重要的技术指标，而单细胞微生物的菌悬浓度与浊度成正比，因此可以用光电比色计测定菌悬的光密度值来推知菌液的浓度，从而得出菌体收获量的最大值。

3、在液体培养中培养基的配方及培养条件对菌体生长或产物积累的影响都是显著的，因而，利用科学的试验方法设计优化试验可以迅速的得出菌体生长或产物积累的最优化培养基配方及培养条件。这些方法主要有正交设计、均匀设计、响应面法等，其中响应面法是应用得比较普遍的方法之一。

4、YSCP的生产采用液体深层发酵，发酵过程参数的变化对YSCP的生产效率影响显著，掌握发酵过程参数检测及调控方法能有效的优化发酵过程。

三、实验材料及仪器

1、菌种：产朊假丝酵母

2、药品：（试剂为AR级）

葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、海藻酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锌、亚硫酸钠、氯化钾、氯化钠、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、重铬酸钾、碳酸钙、酚酞、氯化铵、氨水、硫酸、消泡油、乙醇。

3、器材：

脱脂棉、线绳、牛皮纸、pH试纸、擦镜纸、滤纸、漏斗、镊子、剪刀、摇瓶用盖膜、滴定管、试管、三角瓶、量筒、移液管、吸嘴、血球计数板等

4、仪器及设备：

培养箱、摇瓶机、超净台、SY3010型全自动发酵罐系统、计算机、灭菌锅、pH计、手持式移液枪（5mL，1mL）分光光度计、电热烘箱、电子天平、离心机、显微镜

四、实验内容及步骤

1、小型自控发酵罐的构造及培养基灭菌

（1）小型自控罐的罐体构造

教师结合现有设备讲解，学生画出罐体及主要接口。

（2）小型自控罐的管路布置

教师结合现有设备讲解，学生画出相关管路。

（3）小型自控罐的灭菌操作

全自动发酵系统采用就地蒸汽灭菌，所需蒸汽压力应在0.2Mpa~0.3Mpa。蒸汽用量为20公斤/时。系统的灭菌包括发酵罐培养基的灭菌，空气过滤器及空气管道的灭菌，以及取样阀的灭菌。为保证培养液的浓度，一般采用夹套间接蒸汽灭菌。灭菌操作过程大致如下：开启蒸汽管路阀门，把剩水排放掉。升温至121℃时即可计时开始。根据培养基的性质确保发酵时间，一般为30分钟。在此时间内应保证温度不低于120℃.当计时开始后，可进行空气过滤器及空气管道等各管道的灭菌。在灭菌过程中请注意各阀门的开关。

灭菌结束后，温度可切入自动控温状态。使培养基达到接种温度。灭菌过程即告结束。

2、酵母菌生长动力学实验：

（1）发酵培养基配方：葡萄糖50g/L、酵母膏8g/L、玉米浆20g/L、K2HPO4 5g/L、ZnSO4 0.2 g/L、MgSO4 0.7 g/L、FeSO4 0.9g/L、pH6.5 121℃灭菌20min。配制6L

种子培养基：葡萄糖35g/L、酵母膏10g/L、玉米浆20g/L、K2HPO4 5g/L、ZnSO4 0.2 g/L、MgSO40.5 g/L、FeSO4 0.7 g/L、pH6.5 121℃灭菌20min。接种量5%（v/v），配制300mL 种子培养基，150mL/△瓶。

流加培养基配方：葡萄糖溶液：取50g葡萄糖溶于150mL蒸馏水中，装入△瓶灭菌。玉米浆溶液：取7mL玉米浆溶于150mL蒸馏水中，装入△瓶灭菌。

（2）接种量5%，发酵罐装液6L，流加2L（每4h流加1次，共6次，每次300mL，共配制150mL/△瓶流加培养基12瓶，一次使用2瓶，其中一瓶为葡萄糖溶液、一瓶为玉米浆溶液）。

（3）对照：取灭菌后的培养液于比色管中冰箱保存备用。

（4）取样测定：在发酵培养过程中每2h取样于比色管中冰箱保存备用，以0h未接种的发酵液为对照，测定0、2、4、6、8……….20、22、24h（直至OD值变化不大）的OD560。（5）测定核酸及蛋白质含量：