草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆及表达分析

草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆及表达分析

陈阳;孙华山;王玉书;张学通;师冉;熊良兵;金一锋

【摘要】氮素是制约草坪草生长发育的重要因素之一,GS/GOGAT循环是植物氮同化的主要途径,谷氨酸合酶(glu-tamine:2-oxoglutarate amidotransferase,glutamate synthase,GOGAT)在植物氮素转化过程中发挥着重要的催化作用.本研究以草地早熟禾(Poa pratensis)为试材,基于二代测序RNA-seq相关数据,克隆得到草地早熟禾NADH-GOGAT基因,并进行生物信息学分析.结果表明:草地早熟禾NADH-GOGAT基因序列为3236 bp,完整的开放阅读框(Open Reading Frame Finder,ORF)为1338 bp,编码445个氨基酸残基组成的蛋白;预测NADH-GOGAT蛋白的分子量为49.89KD,等电点(isoelectric point,pI)为6.11,无信号肽,含有1个Glu-syn-central结构域,属于Glu-syn-central超级家族;二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主;同源进化分析结果表明草地早熟禾NADH-GOGAT与硬粒黑小麦氨基酸序列相似度为97％.草地早熟禾NADH-GOGAT基因在叶部的相对表达量高于根与茎,低氮浓度更有利于该基因的表达.NADH-GOGAT在干旱胁迫和水氮互作中表达差异显著(P<0.05).草地早熟禾NA D H-GOGA T基因的克隆,及相关序列分析和基因表达,对进一步研究该基因的功能和草地早熟禾GS/GOGA T循环的调控过程具有一定意义.

【期刊名称】《草地学报》

【年(卷),期】2019(027)002

【总页数】7页(P459-465)

【关键词】草地早熟禾;谷氨酸合酶;基因克隆;氮素调控

【作者】陈阳;孙华山;王玉书;张学通;师冉;熊良兵;金一锋

【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,抗性基因工程与寒地生物多样性

保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;东北农业大学园艺园林学院,黑

龙江哈尔滨150030;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,抗性基因工程与寒地生物

多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学

与农林学院,抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐

哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,抗性基因工程与寒地生物多样性

保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林

学院,抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006

【正文语种】中文

【中图分类】S543

草地早熟禾(Poa pratensis)作为优质的冷季型草坪草，凭借良好的坪用性状及耐

寒性广泛应用于我国北方的园林绿化[1]。植物氮素利用效率与水分利用效率密切

相关，两者也是节水农业的热点与难点。草地早熟禾喜肥喜水，缺氮、缺水易造成植物萎蔫，叶色发黄，病害加重。我国北方城市水资源匮乏，而且氮肥的利用率较低，氮肥的过度施加易造成经济和资源的浪费，不利于资源节约型生态社会的建设，水分及氮素营养制约着草坪业的健康发展。如何进一步实现草地早熟禾在节水条件下对氮素的高效利用，已经成为草业领域不可忽视的问题。

GS/GOGAT(Glutamine synthetase/Glutamate synthase，谷氨酰胺合成酶/谷

氨酸合成酶)循环是植物氮同化的主要途径[2]，植物通过对硝态氮的还原、植物衰老氮素再利用、根瘤菌固氮和氨基酸代谢等途径获得氨，将谷氨酸和氨态氮通过GS酶的催化反应生成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺和酮戊二酸经过GOGAT酶的催化形成谷氨酸和其他氨基酸供植物利用。GS/GOGAT的同工酶活性相关研究较为深入。针对油菜(Brassica napus)[3]研究发现，缺氮时GOGAT对子粒氮素积累、作物产量形成及作物体内氮素再利用影响很大，GS影响较小。甜菜(Beta vulgaris)[4]叶片铵态氮的同化以GS2/GOGAT为主。不同基因型大豆叶片NADH-GOGAT的活性变化存在差异。目前拟南芥(Arabidopsis thaliana)[5]、水稻(Oryza sativa)[6]、大麦(Hordeum vulgare)[7]、玉米(Zea mays)[8]等多种植物的GS基因被成功克隆，且功能研究较深入。大部分GS/GOGAT循环的研究更多的关注GS在氮同化过程中的作用，而忽视了GOGAT的作用。GOGAT是连接氮无机和有机同化的纽带，在作物氮代谢中具有重要作用。GOGAT主要以2种形式作用于植物中，一种形式为Fd-GOGAT，其功能与光合作用和呼吸作用有关，主要位于质体和叶绿体中；另一类为NADH-GOGAT，参与氮类化合物的转移运输，主要位于根瘤菌、根、茎和细胞质中。水稻[9]中NADH-GOGAT有利于生长器官中转运来的谷氨酰胺的再利用。紫花苜蓿(Medicago sativa)[10]NADH-GOGAT基因在根瘤中共生固定氮同化成氨基酸过程中起主要作用。拟南芥[11]NADH-GOGAT在非光致呼吸性氨同化和谷氨酸合成中对植物发育的起重要作用，Fd-GOGAT参与氮的初级吸收与光呼吸释放氨的再吸收。目前，针对草坪草GOGAT的基因研究未有报道。本研究拟克隆得到草地早熟禾NADH-GOGAT 基因，并进行生物信息学分析，包括蛋白质结构预测，同源进化分析，功能结构域分析等。通过实时荧光定量PCR分析NADH-GOGAT基因在不同组织部位，氮素调控、干旱胁迫及水氮互作中表达情况。本研究为探究草地早熟禾NADH-GOGAT基因的功能，进一步研究草地早熟禾GS/GOGAT循环的调控过程奠定基