固定化酶技术及其应用

固定化酶技术及其应用

拜永孝李彦锋*马应霞周林成马鹏程(兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室兰州大学生物化工及环境技术研究所兰州大学化学化工学院兰州 730000)

摘要固定化酶技术作为一门交叉学科技术，在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。新型载体材料的合成是今后固定化酶发展的一个非常重要的研究领

域。在酶的固定化中天然材料和智能材料也同样起着重要的作用。随着新技术的发展能够在温和条件

下获得高活性的固定化酶已成为现实，如定向固定化酶、超声技术和辐射技术固定化酶等。本文结合

自己的工作介绍了固定化酶制备及应用的研究现状和发展趋势。

关键词固定化酶载体酶促反应应用

Technologies of Immobilized Enzymes and Their Applications

Bai Yongxiao, Li Yanfeng*, Ma Yingxia, Zhou Lincheng, Ma Pengcheng (State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry, Institute of Biochemical Engineering & Environmental Technology, College of Chemistry

and Chemical Engineering,Lanzhou University, Lanzhou 730000)

Abstract The synthesis of novel carrier material for immobilization enzyme is one of the most important research fields for the future development of the enzyme immobilization. The intelligent material

and the natural carrier materials also play important roles in enzyme immobilization. Based on the usage of

new scientific technology, such as oriented immobilization, immobilization by using ultrasonic and radiation,

highly active immobilized enzyme can be got under mild conditions. Together with the authors’ research works, the status of the preparation and applications of immobilization enzyme and its development are introduced.

Key words Immobilized enzymes, Carriers, Enzymatic reaction, Applications

酶是高效、专一性强的生物催化剂。生物体内的各种化学反应都是在酶催化下进行的，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能一次性地起催化作用，同时，酶是蛋白质对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易失活而降低其催化能力，这些不足大大限制了酶促反应的广泛应用。上世纪60年代出现的固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，并且酶可以回收及重复使用[1]，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。酶(细胞)的固定化方法可大致分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4种[2]。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良

拜永孝男，博士生，现从事生物活性高分子的研究。∗联系人 E-mail: liyf@

好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。上述各种固定化酶(细胞)的方法所表现出的不足之处限制了其广泛应用，因此，设计和合成性能优异的新型酶固定化材料，研制开发简便、实用的固定化方法是目前固定化酶研究的重点之一。

1新型载体材料及固定化技术

酶(细胞)固定化对载体材料具有很高的要求，理想的载体要有良好的机械强度、热稳定性及化学稳定性、耐微生物降解性和对酶的高结合能力等。高分子复合物[3]是由两种不同的高分子链通过氢键等次价键聚集成的具有一些特殊功能的复合物，其优良的质量传递性能、电解质的灵敏介电特性以及生物相容性等特点，为酶的固定化技术提供了一种新型载体。将无机载体表面用有机聚合物进行修饰，然后再与酶结合制得的固定化酶具有良好的机械强度和热稳定性。薛屏等[4]制备了一种具有长程有序结构、孔径分布窄的含铁介孔分子筛MCM-41，分别利用直接法和共价结合法将青霉素酰化酶固定在分子筛表面，所得固定化青霉素酰化酶对青霉素G水解反应表观活性较高、且共价结合法的操作稳定性优于直接法。将纳米级的金、银离子吸附于聚氨基甲酸乙酯的孔中，所得复合载体经固定化酶后表现出良好的催化活性、且对温度及pH的稳定性均有所提高[5]。将多孔硅球进行处理形成氨丙基多孔硅球，再用戊二醛作交联剂与酶共价偶联时酶的渗漏现象得以解决[6]，贺枫等[7]用此法固定化胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶都获得了良好的效果。叶蕴华等[8]阐述了沸石和分子筛作为载体通过吸附法固定化酶的最新进展并讨论了影响酶固定化效率和影响固定化酶在有机介质中催化活性的各种因素，指出随着生物技术、材料化学及表面化学的发展将会使得沸石和分子筛作为固定化酶载体材料得到更好的发展和实际应用。Alta等[9]将二甲基硅烷和吡咯的嵌段共聚物用于酶的固定化，表明其共聚物比用聚吡咯载体固定化酶具有更高的相对活力和操作稳定性。磁性载体固定化酶后可借助外部磁场方便简单地回收固定化酶、提高了酶的使用效率，近年来这一技术发展较为迅速。邱广亮等[10]用聚乙二醇磁性胶体离子作为固定化α-淀粉酶的载体。该载体内部为磁性氧化铁，外围缠绕聚乙二醇，其表面具有两亲性，可稳定分散于水溶液和有机溶剂中，在反应中充分发挥了酶的催化作用，同时，在较弱的外部磁场作用下，磁性载体快速沉降，有利于固定化酶的回收和重复使用。光敏性单体聚合包埋固定化酶或带光敏性基团的载体固定化酶时[11]，由于固定化条件温和，因而可获得高酶活力及高稳定性的固定化酶。pH响应性高分子作为一类新的固定化酶载体也得到了广泛的研究。Fujimura等[12]利用丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸三元共聚物(MPM-06)固定蛋白水解酶。这种固定化酶在pH5.8以上为溶解状态，在pH4.8以下则发生沉淀，因而可通过调节pH进行酶促反应和回收酶。这类载体材料具有均相催化与异相分离的优点，但同时也具有致命缺点，如对于一些pH十分敏感的酶及其最佳pH不在此范围内的酶，这类载体就不适用。因此，人们合成了一种通过温度来改变沉淀—溶解状态的载体材料。Heskins等[13]报道了N-异丙基丙烯酰胺的水溶液具有低临界溶解温度(LCST)特性，即可通过升温或降温来调节聚N-异丙基丙烯酰胺在水中的沉淀