固定化酶技术及其应用

固定化酶技术及其应用
拜永孝李彦锋*马应霞周林成马鹏程(兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室兰州大学生物化工及环境技术研究所兰州大学化学化工学院兰州 730000)
摘要固定化酶技术作为一门交叉学科技术，在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。

新型载体材料的合成是今后固定化酶发展的一个非常重要的研究领
域。

在酶的固定化中天然材料和智能材料也同样起着重要的作用。

随着新技术的发展能够在温和条件
下获得高活性的固定化酶已成为现实，如定向固定化酶、超声技术和辐射技术固定化酶等。

本文结合
自己的工作介绍了固定化酶制备及应用的研究现状和发展趋势。

关键词固定化酶载体酶促反应应用
Technologies of Immobilized Enzymes and Their Applications
Bai Yongxiao, Li Yanfeng*, Ma Yingxia, Zhou Lincheng, Ma Pengcheng (State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry, Institute of Biochemical Engineering & Environmental Technology, College of Chemistry
and Chemical Engineering,Lanzhou University, Lanzhou 730000)
Abstract The synthesis of novel carrier material for immobilization enzyme is one of the most important research fields for the future development of the enzyme immobilization. The intelligent material
and the natural carrier materials also play important roles in enzyme immobilization. Based on the usage of
new scientific technology, such as oriented immobilization, immobilization by using ultrasonic and radiation,
highly active immobilized enzyme can be got under mild conditions. Together with the authors’ research works, the status of the preparation and applications of immobilization enzyme and its development are introduced.
Key words Immobilized enzymes, Carriers, Enzymatic reaction, Applications
酶是高效、专一性强的生物催化剂。

生物体内的各种化学反应都是在酶催化下进行的，但是自由酶在水溶液中很不稳定，可溶性酶一般只能一次性地起催化作用，同时，酶是蛋白质对热、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等均不够稳定，容易失活而降低其催化能力，这些不足大大限制了酶促反应的广泛应用。

上世纪60年代出现的固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，并且酶可以回收及重复使用[1]，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。

酶(细胞)的固定化方法可大致分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4种[2]。

吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。

该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。

共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良
拜永孝男，博士生，现从事生物活性高分子的研究。

∗联系人 E-mail: liyf@
好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。

交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。

包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。

上述各种固定化酶(细胞)的方法所表现出的不足之处限制了其广泛应用，因此，设计和合成性能优异的新型酶固定化材料，研制开发简便、实用的固定化方法是目前固定化酶研究的重点之一。

1新型载体材料及固定化技术
酶(细胞)固定化对载体材料具有很高的要求，理想的载体要有良好的机械强度、热稳定性及化学稳定性、耐微生物降解性和对酶的高结合能力等。

高分子复合物[3]是由两种不同的高分子链通过氢键等次价键聚集成的具有一些特殊功能的复合物，其优良的质量传递性能、电解质的灵敏介电特性以及生物相容性等特点，为酶的固定化技术提供了一种新型载体。

将无机载体表面用有机聚合物进行修饰，然后再与酶结合制得的固定化酶具有良好的机械强度和热稳定性。

薛屏等[4]制备了一种具有长程有序结构、孔径分布窄的含铁介孔分子筛MCM-41，分别利用直接法和共价结合法将青霉素酰化酶固定在分子筛表面，所得固定化青霉素酰化酶对青霉素G水解反应表观活性较高、且共价结合法的操作稳定性优于直接法。

将纳米级的金、银离子吸附于聚氨基甲酸乙酯的孔中，所得复合载体经固定化酶后表现出良好的催化活性、且对温度及pH的稳定性均有所提高[5]。

将多孔硅球进行处理形成氨丙基多孔硅球，再用戊二醛作交联剂与酶共价偶联时酶的渗漏现象得以解决[6]，贺枫等[7]用此法固定化胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶都获得了良好的效果。

叶蕴华等[8]阐述了沸石和分子筛作为载体通过吸附法固定化酶的最新进展并讨论了影响酶固定化效率和影响固定化酶在有机介质中催化活性的各种因素，指出随着生物技术、材料化学及表面化学的发展将会使得沸石和分子筛作为固定化酶载体材料得到更好的发展和实际应用。

Alta等[9]将二甲基硅烷和吡咯的嵌段共聚物用于酶的固定化，表明其共聚物比用聚吡咯载体固定化酶具有更高的相对活力和操作稳定性。

磁性载体固定化酶后可借助外部磁场方便简单地回收固定化酶、提高了酶的使用效率，近年来这一技术发展较为迅速。

邱广亮等[10]用聚乙二醇磁性胶体离子作为固定化α-淀粉酶的载体。

该载体内部为磁性氧化铁，外围缠绕聚乙二醇，其表面具有两亲性，可稳定分散于水溶液和有机溶剂中，在反应中充分发挥了酶的催化作用，同时，在较弱的外部磁场作用下，磁性载体快速沉降，有利于固定化酶的回收和重复使用。

光敏性单体聚合包埋固定化酶或带光敏性基团的载体固定化酶时[11]，由于固定化条件温和，因而可获得高酶活力及高稳定性的固定化酶。

pH响应性高分子作为一类新的固定化酶载体也得到了广泛的研究。

Fujimura等[12]利用丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸三元共聚物(MPM-06)固定蛋白水解酶。

这种固定化酶在pH5.8以上为溶解状态，在pH4.8以下则发生沉淀，因而可通过调节pH进行酶促反应和回收酶。

这类载体材料具有均相催化与异相分离的优点，但同时也具有致命缺点，如对于一些pH十分敏感的酶及其最佳pH不在此范围内的酶，这类载体就不适用。

因此，人们合成了一种通过温度来改变沉淀—溶解状态的载体材料。

Heskins等[13]报道了N-异丙基丙烯酰胺的水溶液具有低临界溶解温度(LCST)特性，即可通过升温或降温来调节聚N-异丙基丙烯酰胺在水中的沉淀
或溶解。

V orlop等[14]通过N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚得到了一种温度敏感性载体。

同时，光响应、压力响应及离子强度响应材料也将会成为固定化酶载体的新型材料。

吸附法的载体是多种多样的，如离子交换树脂、寅式盐、活性炭、氧化铝、多孔玻璃等多孔状无机载体。

微孔分子筛及沸石由于其特有的物理和化学性质而引起了广泛的关注和研究，最近发现的中孔分子筛MCM-41也表现出潜在的应用价值。

作为固定化酶的载体材料它们都表现出良好的特性，如高比表面积、亲水或疏水特性、静电作用、物理和化学稳定性及抗微生物降解性等[8]。

共价偶联法是应用较为广泛的固定化酶的传统方法。

但由于反应过程中酶的活性部位易受到破坏，有的可能完全失活，故在固定化技术方面也必须寻求新的途径。

总的原则是在较为温和的条件下进行酶的固定化以减少酶活力的损失，如超声波作用下的酶固定化过程[15]仅有部分失活或完全不失活。

辐射技术也在固定化酶领域得到应用，γ-射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶并呈现出良好的结果，60Co辐照低温下单体与酶的混合液使酶包埋固定化，有利于酶活力的提高。

用等离子体修饰聚砜固定化酶表现出较高的酶活力[16,17]，Demarn等[18]用等离子体引发丙烯酰胺(AM)聚合的载体包埋固定化葡萄糖氧化酶(GOD)，使得酶的稳定性和活性均得到了显著提高。

传统的酶固定化方法中酶是在随意位点和载体进行连接的[19]，酶的多个位点可能同时与载体结合，以致会阻碍底物进入到酶的活性位点，同时，多位点结合也会降低固定化酶的载酶量[20]，所以，酶的定向固定化研究日益受到重视。

由于酶的定向固定化具有容量大、活性高的优点，将成为今后固定化酶方法研究的一大热点。

Schmid[21]、Viswanath[22]等对酶的定向固定进行了研究。

另外，超临界流体条件下进行聚合包埋，采用纳米粒子进行原位共聚包埋等，都是今后酶固定化技术研究的方向。

2传统载体材料及固定化技术的改进
保持各种传统固定化酶(细胞)的优点，同时改进其不足是固定化酶(细胞)研究的重要内容之一。

在酶包埋材料中渗入特定粒子以增加其密度或赋予磁性[23,24]，将有利于改善其传质、吸附及分离性能。

明胶包埋—戊二醛交联法中的戊二醛对微生物有毒害，当改用高碘酸钾氧化淀粉作偶联剂时则发现能保持菌体的高活性且非常适合在生物反应器中应用[25]。

两种或多种固定化方法同时运用能改进单一固定化方法的不足，如将酶吸附于离子交换树脂上后再用多功能基化合物交联可提高固定化胰蛋白酶的活性及稳定性[26]。

对某一方法的部分改进也能提高固定化酶的活力，如将戊二醛的一端用二乙醇胺保护后活化载体，再脱保护并用于固定化酶，避免了载体或酶的自身交联反应，从而可以较大幅度地提高固定化酶的酶活力回收[27]。

调节pH使酶固定化及固定化酶处于一个最佳环境中[28]，也是提高酶活力的一种途径。

考虑到酶是生物大分子以及某些大分子底物与产物的传质和扩散的需要[29]，李彦锋等[30]采用线型聚合物致孔法合成了球状特大孔丙烯腈-醋酸乙烯酯共聚物(MR-A V树脂)，再转化为聚丙烯偕胺肟—聚乙烯醇载体固定化嗜热杆菌蛋白酶，结果表明固定化酶活性随载体孔径的增大而提高。

李彦锋等采用MR-A V树脂与含水乙二胺反应得到大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺—聚乙烯醇载体时，其亲水性进一步增强，用于固定化木瓜蛋白酶[31]时可获得良好结果。

利用空间悬臂技术将减小酶促反应及固定化酶时的空间阻碍而提高固定化酶的活性[32]，如采用不同链长的二元胺等交联剂活化聚氯乙烯[33]及聚丙烯酸甲酯[34]等大孔球状载体时，固定化酶的活力随着侧基的链长增加而提高。

纤维状载体的比表面积
大、传质性能好、理化性能优异，如化学改性后的腈纶纤维用于固定化木瓜蛋白酶时，具有较高的酶活力回收及良好的酶促反应活性[35]。

叶蕴华等[36]认为固定化酶的载体应具有一定的亲水性，疏水性载体因缺少必须水而使固定化酶失活。

但是载体的亲水性太强，酶的催化效果也不理想。

同时载体孔径、颗粒大小也可能对固定化酶催化反应的活性产生影响。

由于天然载体具有适宜的生物相容性及亲水性，因而对天然载体的各种改性及修饰也成为目前固定化酶材料及方法的另一发展方向。

3多酶系统及固定化细胞技术的发展
因为有些酶在酶促反应过程中需要辅酶，特别是某些产品的生物合成中需要多步酶促反应才能完成，因而发展了制备多酶固定化反应系统的技术。

葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶共同固定化，黄素氧化酶与过氧化氢酶及超氧化物歧化酶共同固定化等都是人们熟悉的多酶共固定化的例子。

李振华等[37]将α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶进行了共固定化，所得共固定化酶使淀粉转化为果糖。

固定化细胞是固定化酶技术的进一步发展。

死细胞的固定化则相当于一个多酶贮袋的固定化、类似于多酶共固定化，但其酶促行为则优于后者。

活细胞的固定化则是现代生物工程技术领域最为活跃的研究课题之一，固定化细胞的实际应用甚至超过了固定化酶的应用，其应用已在生物工程、生物环境、食品科学、药物科学等领域得到了长足的发展。

固定化细胞倍受重视的原因是：首先它可以省去酶的分离纯化工作，减少酶活性损失；其次固定化细胞可以利用它所包含的多酶系统完成催化过程，比固定化酶更具优势。

目前日本和欧美各国都在开发这一技术，有的已应用于工业生产。

4固定化酶(细胞)的应用研究
固定化酶不仅在生命科学和医学领域而且在生物学及化学领域已有广泛的应用。

叶蕴华等[38]首次通过将蛋白酶吸附固定在微孔分子筛MCM-22上，在有机溶剂中通过3+2路线合成了生物活性五肽前驱体OGP-(10-14)，Z-Tyr-Gly-Phe-Gly-OEt和脑啡肽片段，同自由酶相比固定化蛋白酶的催化反应速率和收率在多数情况下均有较大提高。

叶蕴华等[39]首次用微孔Y沸石(HY，NH4Y，NaY)和中孔DAY沸石(HDAY，HNH4DAY)作载体固定化α-胰凝乳蛋白酶和嗜热菌蛋白酶在有机溶剂中催化合成肽，结果表明微孔Y沸石的固定化效率高于中孔DAY沸石。

张国政等[40]研究了在有机溶剂中将脂肪酶固定在树脂及硅藻土上，固定化脂肪酶的回收率达48.3%，且稳定性好、半衰期为360h。

由于脂肪酶在非水相中不同于在水相中，不存在酶的脱落流失问题，因而采用吸附法较为理想[41]。

蛋白水解酶固定化后亦可用于肽及有机化合物的酶促合成[42]。

药用酶可通过固定化提高稳定性及缓释性，并可除去免疫原性。

微囊固定化过氧化氢酶具有良好的酶活性及稳定性，在临床检测及卫生防疫方面具有广泛用途[43]。

酶的固定化技术的发展使生物传感器应运而生[44]。

如利用活蚕液状丝素蛋白的变性作用制备的葡萄糖氧化酶传感器具有酶活性损失小、响应速度快及使用寿命长等优点[45]。

聚吡咯固定化脲酶传感器在脲浓度为(5.0×10-5～1.0×10-2)mol/L范围内具有良好的电化学响应性[46]。

脂肪酶既能催化天然油脂及酯类水解，也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要的工业价值[47]。

卓仁禧等[48]合成多种树脂及温度敏感的沉淀—溶解性能聚合物材料，同时制备了性能各异的固定化嗜热杆菌蛋白
酶，在二肽甜味剂前体Aspartame 的酶促合成中应用取得了良好的结果。

另外固定化酶(细胞)在制药、食品工业、环境治理等领域也有广泛的应用。

固定化酶(细胞)还可用于研究微生物代谢机理，生物发光机理等基础理论研究中。

5展望
自上世纪60年代以来，固定化酶(细胞)的研究得到了长足的发展，取得了许多重要成果、已经产生并将继续产生巨大的经济和社会效益。

然而，固定化酶(细胞)研究具有的高新技术特征与基础理论意义，仍使其处于国际学科前沿，具有很大的研究发展空间。

设计和开发新的合成载体材料，利用和改性质优价廉的天然高分子载体材料，探索和研究新的固定化技术将是这一领域的基础性研究。

合成具有特定反应性官能团的功能高分子大孔载体，使其所带有的功能基与所吸附酶(细胞)的氨基、羧基等蛋白质残基在温和条件下通过共价偶联，这样所制备的固定化酶(细胞)具有较小的酶活力损失、传质效率高且使其同时具有吸附法及共价偶联法的优势和杜绝了包埋法的缺点，因而是固定化酶(细胞)载体材料今后的发展方向。

同时研究高分子和特定无机材料的复合材料将是固定化酶(细胞)载体的另一个发展方向。

另外，要充分重视和利用沸石、分子筛等无机材料作为固定化酶的载体。

因为此类载体材料不仅价格低廉，同时还具有比有机高分子材料更好的物理稳定性、化学稳定性及抗微生物降解性。

尤其重视用此类载体固定化酶的相关应用方面。

拓展新的应用领域并研究解决应用过程中出现的种种问题是固定化酶(细胞)技术发展的保证。

现代工农业生产、现代生物工程、生物医学工程、生物环境工程以及科学技术领域的基础理论研究需求等将是固定化酶(细胞)技术持续发展的动力。

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