第二章基因克隆载体的种类和特性

1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘ Cop
起始蛋白 ↘ Rep
Pcop cop
P/Orep
ori
rep
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution
model) 关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其 浓度同质粒的拷贝数成正比。 • *自体阻遏蛋白质模型(Autorepressor model) 关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈 (Negative feedback)机理调节，而且其浓度是 恒定的。
Multiple Cloning Site,即多克隆位点，MCS） • （5）具有合适的选择性标记
3、载体的种类
• （1）质粒（plasmid）载体（又可分为：克隆载 体、中间载体、穿梭载体和表达载体）
• （2）噬菌体（phage）载体 A、λ—噬菌体 B、考斯质粒（粘性质粒）（cosmid) C、M13—DNA（单链丝状噬菌体）
1、质粒的自主复制性：
• 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 • 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 • 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低 拷贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不 受寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以 高拷贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
第二章基因克隆载体的 种类和特性
2021年4月15日星期四
第二章
基因克隆载体的种类和特性
基因工程的基本条件
• A 目的基因
（从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和扩大繁殖获 得足够量的目的基因或cDNA序列）
• B 用于基因克隆的载体
（合适的载体，并对载体DNA进行克隆，制备足够量又达到一定 纯度的载体DNA）
• （3）酵母人工染色体载体（YAC） • （4）细菌人工染色体载体（BAC） • （5）其他载体
4、载体的要求
• 独立复制 • 可插入外源片段 • 易分离，易操作
二、质粒（plasmid)
1、质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、 闭合、环状双链DNA分子（Covalently closed circular DNA, ccc DNA)，质粒是一类引人注目的亚细胞有机体，其结构比病 毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在 寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。
质粒DNA大小范围：一般在1-200kb之间,多数10kb左右
质粒常见于原核细菌Байду номын сангаас真菌中
质粒的发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如
pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和
2、它并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环 境因素不利影响的能力。质粒类型多种多样，有F质粒也叫性质 粒；有编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒，R质粒可将其抗性 转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗 菌素抗性能力；有产生大肠杆菌毒素的Col质粒等。
3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在 一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的 复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
• C 用于核酸操作的工具酶 • D 用于基因转移的受体菌或细胞（宿主细胞）
（能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗 传改良的细胞）
一、载体的功能、特征及种类
• 载体（vector)： 携带外源基因(或DNA片段)进入受体细胞（复制、整合或表 达）的工具。
使用载体的目的
• 基因的复制扩增 • 基因的表达 • 基因的整合 • 基因的调控 • 其他
4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启 动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质 粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广 泛。
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。关于质粒DNA的大小, 文献中有多种说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求
，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及 各种探针型载体。
质粒载体是上世纪70年代实验室普遍使用的基因克隆载体。
（一）质粒的生物学特点
• 1、自主复制性(Self-replication)： • 2、相容性和不相容性(incompatibility) ： • 3、可转移性(transferability or transitivity)：
2、质粒的相容性和不相容性(又称为亲和性与不亲和性)
①：在同一时间内从一个细胞中发现多个不同类型的质粒 ，只有当 不同的质粒是相容的时才能存在于同一个细胞中；
②：质粒的不相容性是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密 切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。不相容 的质粒一般都利用同一复制系统，拷贝多的复制更快，结果在细菌 繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒 。
1、载体的功能
• （1）运送外源基因高效转入受体细胞 • （2）为外源基因提供复制能力或整合能力 • （3）为外源基因的扩增或表达提供条件
2、载体应具备的条件
• （1）具有对受体细胞的可转移性 • （2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点
或整合位点 • （3）长度尽可能小，以提高其载装能力 • （4）具有多种单一的核酸内切酶切割位点（