16s_rdna菌种鉴定

16S rDNA 方法鉴定细菌种属

一．目的

1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。

二、原理

随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16S rDNA 序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA 。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16SrDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。

2、在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

3、16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。

4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA 片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

利用16S rDNA 鉴定细菌的技术路线：

细菌培养液 基因组DNA DNA 提取 PCR 扩增 16S rDNA 片段

片段回收 连接克隆载体

阳性克隆鉴定 测 序

三、操作步骤

（一）细菌基因组DNA 提取

1. 挑单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。

2. 取2 mL 培养液到2 mLEppendorf 管中，8000 rpm 离心2分钟后倒掉上清液。

3. 加140 μLTE 打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml 的溶菌酶。37℃放置10分钟。

4. 加入400 μL Digestion Buffer ，混匀。再加入3 μL Protein K ，混匀，55℃温育5分钟。

5. 加入260 μL 乙醇，混匀，全部转入UNIQ -10柱中。10000 rpm 离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution ），10000 rpm 离心0.5分钟。

7. 重复第六步。

8. 再10000 rpm 离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL 的离心管。

9. 加入50 μL 预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm 离心2分钟，流下的

液体即为基因组DNA 。

10. 电泳。取3 μL 溶液电泳检测质量。

（二）PCR 扩增

1. 根据已发表的16S rDNA 序列设计保守的扩增引物。

16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'

16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3'

2. PCR 扩增体系：

在0.2 mL Eppendorf 管中加入1μL DNA ，再加入以下反应混合液：

16S (F) 1μL (10μM)

16S (R) 1μL (10μM)

10×PCR Buffer 5 μL

dNTP 4 μL

Taq 酶 0.5 μL

加ddH 2O 使反应体系调至50 μL ，简单离心混匀。

3. PCR 反应

将Eppendorf 管放入PCR 仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为：

94℃ 3 min

94℃

30 sec

50℃45 sec 35 cycles

72℃100 sec

72℃7 min

4. PCR产物的电泳检测

拿出Eppendorf管，从中取出5 μL反应产物，加入1μL上样缓冲液，再加入4ul的ddH2O 混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果。

（三）扩增片段的回收

根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。

1）称量一2 mL.的Eppendorf管质量，记录。

2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。3）每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。60℃温育至凝胶融化。

4）全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

5）加入500 μL Binding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。

6）加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。

7）再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。

8）加入30 μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。

（四）DNA片段测序

将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。