16s_rdna菌种鉴定
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16S rDNA 方法鉴定细菌种属
一.目的
1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法;
2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、原理
随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16S rDNA 序列分析等。
细菌中包括有三种核糖体RNA ,分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA ,rRNA 基因由保守区和可变区组成。16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA 。5S rRNA 虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍,分析较困难。而16S rRNA 相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补,而细菌的16SrDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此,16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16SrDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中,这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程,其功能是任何生物都必不可少的,而且在生物进化的漫长历程中保持不变,可看作为生物演变的时间钟。
2、在 16S rRNA 分子中,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。
3、16S rRNA 的相对分子量大小适中,约1 540 个核苷酸,便于序列分析。
4、可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16S rDNA 片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。
利用16S rDNA 鉴定细菌的技术路线:
细菌培养液 基因组DNA DNA 提取 PCR 扩增 16S rDNA 片段
片段回收 连接克隆载体
阳性克隆鉴定 测 序
三、操作步骤
(一)细菌基因组DNA 提取
1. 挑单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL 培养液到2 mLEppendorf 管中,8000 rpm 离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μLTE 打散细菌,再加入60 μL 10 mg/ml 的溶菌酶。37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer ,混匀。再加入3 μL Protein K ,混匀,55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL 乙醇,混匀,全部转入UNIQ -10柱中。10000 rpm 离心1分钟,倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70%乙醇(Wash Solution ),10000 rpm 离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm 离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL 的离心管。
9. 加入50 μL 预热(60℃)的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm 离心2分钟,流下的
液体即为基因组DNA 。
10. 电泳。取3 μL 溶液电泳检测质量。
(二)PCR 扩增
1. 根据已发表的16S rDNA 序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'
16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3'
2. PCR 扩增体系:
在0.2 mL Eppendorf 管中加入1μL DNA ,再加入以下反应混合液:
16S (F) 1μL (10μM)
16S (R) 1μL (10μM)
10×PCR Buffer 5 μL
dNTP 4 μL
Taq 酶 0.5 μL
加ddH 2O 使反应体系调至50 μL ,简单离心混匀。
3. PCR 反应
将Eppendorf 管放入PCR 仪,盖好盖子,调好扩增条件。扩增条件为:
94℃ 3 min
94℃
30 sec
50℃45 sec 35 cycles
72℃100 sec
72℃7 min
4. PCR产物的电泳检测
拿出Eppendorf管,从中取出5 μL反应产物,加入1μL上样缓冲液,再加入4ul的ddH2O 混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1 hr。在紫外灯下检测扩增结果。
(三)扩增片段的回收
根据上步实验结果,如果扩增产物为唯一条带,可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带,并回收目的片段。
1)称量一2 mL.的Eppendorf管质量,记录。
2)在紫外灯下切割含目的条带的凝胶,放入2 mL的Eppendorf管内,称量。计算凝胶质量。3)每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer,混匀。60℃温育至凝胶融化。
4)全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。
5)加入500 μL Binding Buffer,10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。
6)加入70%乙醇(Wash Solution),10000 rpm离心0.5分钟。
7)再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8)加入30 μL预热的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟,流下的液体即为回收的DNA片段。
(四)DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序,测序引物为16S PCR引物。