第八章 酶分子的定向进化_PPT幻灯片
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▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
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第三节 定向进化的策略
一、易错PCR技术为代表的无性进化 二、DNA改组技术为代表的有性进化 三、基因家族之间的同源重组 四、外显子改组 五、杂合酶 六、计算机辅助设计 七、突变库的构建及应用
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一、易错PCR技术为代表的无性进化
• 易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增 目的基因时， 通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，从而 以一定的频率向目的基因中随机引入突变构建突变 库。
交错延伸法（staggered extension process, StEP）： 在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步， 并大大缩短其反应时间，从而只能合成非常短的新 生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存 在的不同模板退火而继续延伸，反复进行直到产生 完整长度的基因，结果产生间隔的含不同模板序列 的含大量突变组合的新生DNA分子。
酶分子存在进化潜力的主要原因如下：
天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同
实际应用中，期待酶的活力和稳定性越高越好，但在生 物体内对环境适应的进化主要表现在整体的适应能力、 调控能力的增强
某些酶或蛋白质待进化的性质不是在生物体内所涉及的， 如对蛋白质药物改造消除其副作用
3
第二节 酶分子定向进化的历史
这个分子进化的实验巧妙地在体外模拟了自然 进化的过程，但没有重要的应用价值。 年后出现了真正有意义的改造酶分子性20 大约 质的定向进化。
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二、奠基阶段
1981年，Hall B G定向改变了大肠杆菌k12的第 二半乳糖苷酶的底物专一性，获得了可以水解半 乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变பைடு நூலகம்。
1986年，Hageman R通过在高温下对含有卡那 霉素的培养基中对携带卡那霉素核苷酸转移酶基 因的突变库进行筛选得到了一个在63℃下稳定的 突变酶和一个在70℃稳定的突变酶。
❖ 一、萌芽阶段 ❖ 二、奠基阶段 ❖ 三、发展阶段
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一、萌芽阶段
20 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 年代Sol Spiegelman利用RNA噬菌体○世纪六 Q进行的体外扩增证明达尔文的自然选择也可以 发生在非细胞体。 Q复制酶在基因组的指数扩增过程中以一定的 频率向基因组中引入突变，导致不同基因组个体 分子之间存在差异，形成一个突变库。此时基因 组个体的选择压力就是复制速度，Q基因组不断 剔除与Q复制酶识别序列无关的顺序以加快复制 速度。
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
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三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重组来构建酶分子的基因突变库。
• 如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种 dNTP浓度等。
• 关键：突变频率适中，理论上每个靶基因导入的取 代残基个数为1.5～5之间。
• 连续易错PCR（sequential error-prone PCR）， 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每 一次获得的小突变累积产生重要的有益突变。
如图8-2。
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其他有性进化
体外随机重组法（random-priming in vitro recombination, PCR）：以单链DNA为模板，配合 一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位 点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发， 这些短DNA片段中也会有少量的点突变。可重复 操作直至获得满意的进化酶性质。
– 通过各种方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 分子的各类信息，以此为依据对酶分子进行改造，这 就是基于序列的合理化设计方案（sequential rational design），如化学修饰、定点突变等。
– 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因 重组、定向筛选等方法对酶进行改造，即利用基因的 可操作性，模拟自然界的演化过程的非合理设计方案 （irrational design），如定向进化、杂合进化等。
第一节 简介
一、理论来源
随着电子科学的迅猛发展及计算机的广泛应用，酶学 研究跨入了新的阶段。
利用基因工程的原理，可以在实验室中模拟自然界中 的漫长进化过程，并由此建立了酶分子的定向进化方 法，用于构建新的非天然酶或改造天然酶分子。
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二、基本原理
▪ 对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面。对 酶分子的改造着重在两个方面：
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二、DNA改组技术为代表的有性进 化
DNA改组又称有性PCR（sexual PCR），基 本操作过程是从正突变基因库中分离出来 的DNA片断用脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割， 得到的随机片断经过不加引物的多次PCR循 环，在PCR循环过程中，随机片断之间互为 模板和引物进行扩增，直到获得全长的基 因，导致来自不同基因的片断之间的重组。
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三、基因家族之间的同源重组
• 以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样 化起源于 PCR等反应中的随机突变，但由于突变大 多是有害的或者是中性的，采用这种过程集中有利 突变的速度比较慢。
• 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的 同源顺序进行DNA改组实现同源重组，由于每一个 天然酶的基因都经过千百万年的进化，并且基因之 间存在比较显著的差异，所以获得的突变重组基因 库中既体现了基因的多样化，又最大限度的排除了 那些不需要的突变。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
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第三节 定向进化的策略
一、易错PCR技术为代表的无性进化 二、DNA改组技术为代表的有性进化 三、基因家族之间的同源重组 四、外显子改组 五、杂合酶 六、计算机辅助设计 七、突变库的构建及应用
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一、易错PCR技术为代表的无性进化
• 易错PCR是在采用Taq酶进行PCR扩增 目的基因时， 通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，从而 以一定的频率向目的基因中随机引入突变构建突变 库。
交错延伸法（staggered extension process, StEP）： 在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步， 并大大缩短其反应时间，从而只能合成非常短的新 生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存 在的不同模板退火而继续延伸，反复进行直到产生 完整长度的基因，结果产生间隔的含不同模板序列 的含大量突变组合的新生DNA分子。
酶分子存在进化潜力的主要原因如下：
天然酶在生物体内存在的环境与酶的实际应用环境不同
实际应用中，期待酶的活力和稳定性越高越好，但在生 物体内对环境适应的进化主要表现在整体的适应能力、 调控能力的增强
某些酶或蛋白质待进化的性质不是在生物体内所涉及的， 如对蛋白质药物改造消除其副作用
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第二节 酶分子定向进化的历史
这个分子进化的实验巧妙地在体外模拟了自然 进化的过程，但没有重要的应用价值。 年后出现了真正有意义的改造酶分子性20 大约 质的定向进化。
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二、奠基阶段
1981年，Hall B G定向改变了大肠杆菌k12的第 二半乳糖苷酶的底物专一性，获得了可以水解半 乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变பைடு நூலகம்。
1986年，Hageman R通过在高温下对含有卡那 霉素的培养基中对携带卡那霉素核苷酸转移酶基 因的突变库进行筛选得到了一个在63℃下稳定的 突变酶和一个在70℃稳定的突变酶。
❖ 一、萌芽阶段 ❖ 二、奠基阶段 ❖ 三、发展阶段
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一、萌芽阶段
20 第一次在分子水平上定向改造单一分子的是 年代Sol Spiegelman利用RNA噬菌体○世纪六 Q进行的体外扩增证明达尔文的自然选择也可以 发生在非细胞体。 Q复制酶在基因组的指数扩增过程中以一定的 频率向基因组中引入突变，导致不同基因组个体 分子之间存在差异，形成一个突变库。此时基因 组个体的选择压力就是复制速度，Q基因组不断 剔除与Q复制酶识别序列无关的顺序以加快复制 速度。
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
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三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重组来构建酶分子的基因突变库。
• 如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种 dNTP浓度等。
• 关键：突变频率适中，理论上每个靶基因导入的取 代残基个数为1.5～5之间。
• 连续易错PCR（sequential error-prone PCR）， 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次 PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每 一次获得的小突变累积产生重要的有益突变。
如图8-2。
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其他有性进化
体外随机重组法（random-priming in vitro recombination, PCR）：以单链DNA为模板，配合 一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位 点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发， 这些短DNA片段中也会有少量的点突变。可重复 操作直至获得满意的进化酶性质。
– 通过各种方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 分子的各类信息，以此为依据对酶分子进行改造，这 就是基于序列的合理化设计方案（sequential rational design），如化学修饰、定点突变等。
– 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基因 重组、定向筛选等方法对酶进行改造，即利用基因的 可操作性，模拟自然界的演化过程的非合理设计方案 （irrational design），如定向进化、杂合进化等。
第一节 简介
一、理论来源
随着电子科学的迅猛发展及计算机的广泛应用，酶学 研究跨入了新的阶段。
利用基因工程的原理，可以在实验室中模拟自然界中 的漫长进化过程，并由此建立了酶分子的定向进化方 法，用于构建新的非天然酶或改造天然酶分子。
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二、基本原理
▪ 对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面。对 酶分子的改造着重在两个方面：
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二、DNA改组技术为代表的有性进 化
DNA改组又称有性PCR（sexual PCR），基 本操作过程是从正突变基因库中分离出来 的DNA片断用脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割， 得到的随机片断经过不加引物的多次PCR循 环，在PCR循环过程中，随机片断之间互为 模板和引物进行扩增，直到获得全长的基 因，导致来自不同基因的片断之间的重组。
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三、基因家族之间的同源重组
• 以单一的酶分子基因进行定向进化时，基因的多样 化起源于 PCR等反应中的随机突变，但由于突变大 多是有害的或者是中性的，采用这种过程集中有利 突变的速度比较慢。
• 从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的 同源顺序进行DNA改组实现同源重组，由于每一个 天然酶的基因都经过千百万年的进化，并且基因之 间存在比较显著的差异，所以获得的突变重组基因 库中既体现了基因的多样化，又最大限度的排除了 那些不需要的突变。