酶联免疫吸附试验课件

常用的酶和底物
• 1、辣根过氧化物酶（horsradish
peroxidase, HRP）
• 糖蛋白主酶 + 亚铁血红素辅基（活性基团） • 纯度：RZ=OD403/OD275, >3.1 • 酶活性：U：1min将1μmol底物转化为产物所
需的酶量。 • 反应式：DH2+H2O2 D+2H2O • 底物：OPD, TMB, 5-ASA, ABTS
加样
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标 本，加酶结合物，加底物。加样时应将所 加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁 上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的 量加入板孔中。
加酶结合物
• 结合物即酶标记的抗体（或抗原），是 ELISA中最关键的试剂。
• ELISA的酶应符合以下要求： 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强 ，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备 成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和 催化能力。最好在受检标本中不存在相同 的酶。另外，它的相应底物易于制备和保 存，价格低廉，有色产物易于测定等。
• 由于酶的催化效率很高，间接地放大了 免疫反应的结果，使测定方法达到很高 的敏感度。
（二）方法类型及反应原理
• 双抗体夹心法 • 间接法 • 竞争法 • 捕获法
1 双抗体夹心法
——是检测抗原最常用的方法
操作步骤
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相 抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与 固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物 ，洗涤除去其他未结合物质。
OPD和TMB的比较
酶作用 后显色
终止液
终止反 应显色
最大吸 收峰
致癌
避光
OPD 橙黄色 H2SO4 棕黄色 492nm 有
固相载体
• 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和 容器，不参与化学反应。
• 可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是 聚苯乙烯。
• ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定 板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常 用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国 际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
实验目的要求
• 掌握ELISA的基本原理 • 掌握ELISA双抗体夹心法检测HBsAg的
原理、操作方法及结果判断 • 熟悉表面抗原检测的临床意义
（一）ELISA的原理
ELISA的基本原理 三种必要的试剂：
• ①固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂 ” （immunosorbent）
• ②酶标记的抗原或抗体，称为"结合物" （conjugate）
应用
• 检测Ab的最常用的方法 • 只要更换不同的固相Ag，可以用一种
酶标二抗检测各种与Ag相应的Ab。
3 竞争法
• 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗 体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越 多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此 阳性反应呈色浅于阴性反应。
• 方法相同
ELISA的基本步骤
• 包被—洗来自百度文库—封闭—洗涤—加样—加酶结合 物—加底物、显色剂—终止液—酶标仪检测
2 间接法
——是检测抗体常用的方法
基本步骤
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相 抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的 特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原 抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留 下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤 过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体 与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上 酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中 受检抗体的量正相关。
封闭
● 包被好的固相载体表面常留有少量未吸 附位点，可非特异地吸附测定时加入的标 本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高 。因此需用1％～5％牛血清白蛋白或5％～ 20％小牛血清等包被一次，消除上述干扰 ，此过程称为封闭。 ● 一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物 是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭 也可得到满意的结果。
• ③酶作用的底物
• 在测定时，受检标本（测定其中的抗体 或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体 起反应。
• 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原 抗体复合物与液体中的其他物质分开。
• 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反 应而结合在固相载体上。此时固相上的 酶量与标本中受检物质的量呈一定的比 例。
• 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成 为有色产物，产物的量与标本中受检物 质的量直接相关，故可根据呈色的深浅 进行定性或定量分析。
3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物 上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结 合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶 量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有 色产物。
应用
• 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等
• 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原， 因其不能形成两位点夹心。
固相载体
• 微颗粒 带有蛋白质结合功能基团，结合容量大 、反应速度快
• 膜载体 硝酸纤维素膜（NC）、玻璃纤维素膜、 尼龙膜，非共价键结合，但吸附能力强 斑点ELISA
洗涤
• 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但 却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来 达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通 过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或 抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性 地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑 料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又 应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键 技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严 格按要求洗涤，不得马虎。
包被
• 将抗原或抗体固定化的过程称为包被 (coating)。换言之，包被即是抗原或抗体 结合到固相载体表面的过程。
• 抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐 缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐 缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释 液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后， 在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小 时被认为具有同等的包被效果。