中药色谱指纹图谱鉴别的概念

中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用

药产业现代化的瓶颈是质量不可控、安全不可靠，后者是指重金属、农药、微生物、化学物质的污染，前者虽然有以中国药典的质量标准模式和指标，与国外的植物药药典一样，均是模仿化学药品的质量控制模式，选定一、二个有效成分、活性成分或指标成分进行鉴别和含量测定。但是种以单一化学成分分析的观点，导致人们力求把中药（天然药物）这一综合的复杂的“整体”分解成便于观察和研究的简单“单元”或“分子”，以便于清楚明确的研究。分析工作者沿着这条思路力求运用各种分析检测手段测定某种有效成分或某一活性成分含量的多少来判断某种药材的质量，对复方制剂也以同样的观点和方法制订其质量标准。实际上对于中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，任何活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效，这是中药与化学合成药品质量标准的根本区别。所以宏观地综合分析成为必然的发展趋势，事实上这也是在人类进入系统科学时代以后，人们的科学认识观念更新，综合分析与整体分析成为分析化学发展的必然的反映。在寻求综合评价中药质量的过程中，值得注意的趋势是色谱指纹图（chromatographic fingerprint）的应用。因为它提供的有关质量的综合信息比单一成分的含量要丰富和有用的多[1]，近来此类研究和文章也日益增多。指纹分析与色谱指纹图谱（图像）分析的概念中药是依靠其所含的多种化学成份发挥综合的医疗作用，这是与化学合成药最根本的区别，现在已逐渐得到人们的认同。因此凭借某一种化学成份定性和定量的传统中药质量评价方法的有效性和专属性渐渐受到质疑。因为任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地评价中药的真伪优劣。尤其如果所检测的指标成份（活性成份）是多种中药的共性成份如熊果酸、齐墩果酸、大黄酸、槲皮素等，则更降低了鉴别的准确和专属。随着客观需要和现代认识论的影响，分析工作者逐渐考虑利用现代先进分析技术分析不同药材的整体特征以提高鉴别的准确性，近年来重新受到关注的色谱指纹图谱分析（chromatographic fingerprint analysis）的概念即植根于此。人的“指纹（fingerprint）”鉴定是开始于19世纪末20世纪初的犯罪学（criminology）和法医学。人的指纹有拱形、环形和螺纹形三种基本模式，这是共性，但每一个人的指纹在细微处却绝对不同，从而形成了指纹的“绝对唯一性（absolute uniqueness）”。由于基因学的发展，近代将指纹分析的概念结合生物技术延伸到DNA指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医学和生命科学的领域。生物样品的DNA指纹图谱分析根据目的不同既强调个体的“唯一性”，也可侧重于整个物种的“唯一性”，忽略个体之间的差异。而利用色谱技术进行指纹图谱分析的中药材鉴别所依据的化学成分是后天的代谢产物，它对生长环境的依赖性很强，即对抗拒或适应环境的变化远比先天性遗传特征要脆弱的多。因而同种植物药材所含代谢产物的组成因生长年限、生长环境的变化而可能产生个体间的较为明显的差异，但是生物的代谢既然也具有遗传性，个体之间就必然有群体共有的相似性（similarity）。这种具有物种唯一性和个体相似性的色谱（图像）具有指纹意义。它借用了法医学的指纹鉴定的概念，但不是概念的重复；色谱指纹图谱（图像）不强调个体的绝对唯一性，而强调同一药材群体的相似性，即物种群体内的唯一性。相似性是通过色谱的整体性和模糊性来体现，这是中药色谱指纹图谱（图像）分析的最基本的属性。分析色谱指纹图谱强调的是“准确的辨认

（accurate recognition）”而不是“精密的计算（precise calculation）”；比较图谱强调的是相似（similarity）而不是“相同(identical)”。在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下，指纹图谱的作用主要是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。 2 色谱指纹图谱（图像）分析是中药鉴别技术的循序发展和延伸中国药典1985年版[一部]中药及中成药的鉴别除理化鉴别外，薄层色谱鉴别的使用频率很高。当时的薄层色谱鉴别全部是以化学对照品做对照，要求供试品色谱中应有与对照品一致的斑点。使用的器材比较简单，操作比较粗糙，只要供试品的色谱中出现与对照品一致的斑点即可。但由于可以得到的化学对照品品种有限，没有化学对照品无法鉴别；而只靠一种化学对照品，往往专属性不够，尤其多种药材共有的成份。因此《中国药典》1990年版修订时，尝试增加了对照药材的薄层色谱鉴别。经过实践，证明可以解决化学对照品不足，以及单靠一种化学对照品难以准确鉴别等急待解决的问题。而且对照药材的色谱给出的信息远比单一化学对照品要多得多。譬如只靠人参皂苷Rb1、Re或Rg1不能区别人参、西洋参、三七、以及它们的根或茎叶；小檗碱解决不了黄连、黄柏和三颗针之间的区别。但是各自的对照药材给出的薄层色谱图却各有特征，依此对照，足资鉴别真伪，甚至可以从完整的色谱图像中区分某些药材的种间差异，如药典收载的黄连三个品种、黄柏两个品种，它们的色谱图像既有共同的特征说明它们的近缘关系，又各有自己的特点，尤其在复方制剂中可以判断原料药材投料的情况。同时，在检验复方制剂时，对照药材的取样要求与实际样品中该药材的处方量相当，从完整的色谱还可以得到投料药材的量化信息。现在已在新药研制中被广泛应用。这种做法实际上已经有了色谱指纹图谱的雏形，只是由于供试品、试验器材、试验操作还欠规范，所以还不能称之为指纹图谱。早在70年代日本和我国部分学者尝试用薄层扫描仪得到的复方成药扫描图谱做为色谱指纹图应用于中成药分析，做了大量工作，只是当时主客观条件限制和时机不成熟，没有得到广泛的认同，但他们的思路是有前瞻性的。自1990年版中国药典薄层色谱鉴别设置对照药材以来10年广泛实践的基础上，现在提高一步，规范药材、工艺、检测，提出色谱指纹图的概念，应该是循序渐进的发展，是现行中药鉴别的延伸。而且通过色谱指纹图的研究可以较全面的提升中药种植、采收、加工、生产、分析检验质量的整体水平[2]，再上一个台阶。当前色谱技术的多样化和检测水平的不断提高也为色谱指纹图谱（图像）研究和应用提供了良好的工作平台。3 国外植物药色谱指纹图谱的应用美国FDA允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图鉴别资料[3]，已为大家熟知，此外，WHO在1996年草药评价指导原则[4]中也有规定，如在“Plant preparations”及“Finished product” 的章节中都提到: “如果不可能鉴别有效成份，则鉴别一种或几种特征成份（如色谱指纹图谱）以保证制剂和产品质量的一致”[4]。欧共体在草药质量指南的注释[5]中提到“草药的质量稳定性单靠测定已知的有效成份是不够的，因为草药及其制剂是以其整体作为有效物质。因此，应该通过色谱指纹图谱显示其所含的各种成分在草药及其制剂中是稳定的，其含量比例能保持恒定。例如欧山楂（花叶）的薄层色谱指纹图谱所显示的结果”。国外关于植物药色谱指纹图的研究论文也日渐增多，他们也认识到草药不可能用一种成分说明某草药的疗效，有些活性成分不明，鉴别很困难，所以提出了色谱指纹图鉴别，基本上都是将色谱色谱指纹图的研究和应用限定在鉴别范畴，目的是用以解决成分复杂、有效成分不明的草药如何监测和证明产品批间质量的稳定。如果成分比较简单，如银杏叶的萜类内酯主要只有4个，而且都是已知的，都有化学对照品，完全可以实现4种内酯的含量测定，所