几丁质对南方根结线虫的生物防治研究

青岛农业大学
毕业论文（设计）
题目：刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalloitae CFCC84958产生的几丁质酶对南方根结线
虫卵的破坏作用
姓名： XXXXX
学院：农学与植物保护学院
专业：植物保护
班级： XXXX 学号： XXXXX
2011 年 5 月 20 日
目录
中文摘要 (1)
Abstrac t (2)
引言 (3)
1材料与方法 (6)
1.1供试菌株 (6)
1.2供试试剂 (6)
1.3产几丁质酶培养条件 (6)
1.4几丁质酶活性测定 (6)
1.4.1几丁质降解酶系活性测定 (6)
1.4.2 N-乙酰葡萄糖胺（NAG）标准曲线 (7)
1.4.3几丁质外切酶活性测定 (7)
1.4.4对硝基苯酚（pNP）标准曲线 (7)
1.5刀孢蜡蚧菌产生的几丁质酶对根结线虫卵的破坏 (8)
1.5.1根结线虫卵悬液的制备 (8)
1.5.2卵孵化抑制率及破坏率的测定 (8)
2结果与分析 (9)
2.1几丁质降解酶系活性测定的结果 (9)
2.2几丁质外切酶活性测定的结果 (9)
2.3刀孢蜡蚧菌培养滤液对卵孵化的影响 (10)
2.4南方根结线虫卵壳的形态变化 (11)
2.5结论 (12)
3讨论与展望 (13)
3.1讨论 (13)
3.2展望 (13)
3.2.1安全性评价 (13)
3.2.2根结线虫生物防治展望 (13)
致谢 (15)
参考文献 (16)
刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalloitae CFCC84958产生的几丁质酶对南方根结线虫卵的破坏作用
植物保护专业 XXXX
指导教师 XXX
摘要：根结线虫卵壳主要是由几丁质和蛋白质构成。

根结线虫卵寄生或产毒真菌产生几丁质酶活性是评价食线虫菌物生物防治潜力的重要生化指标之一。

本研究分别采用根结线虫卵寄生真菌刀孢蜡蚧菌，测定其产生的几丁质降解酶活性，该菌的培养滤液从第2d具有几丁质降解酶系活性，第4-6d就达到酶活性高峰值3.98 μmol /h mL；从第2d开始就产生几丁质外切酶，第4d酶活性为0.26umol/h mL。

表明刀孢蜡蚧菌CFCC84958菌株具有较高产生几丁质酶的活性。

该菌4d的培养滤液对根结线虫卵孵化和破坏作用随浓度的增加而增强，7d后孵化抑制率和破坏率分别为94.52%和84.32%。

显微观察线虫卵壳变形和破坏情况的结果表明，刀孢蜡蚧菌CFCC84958产生的几丁质酶可以引致根结线虫卵壳的裂解，抑制根结线虫卵的孵化。

关键词：根结线虫卵；刀孢蜡蚧菌；几丁质酶；卵破坏；卵孵化
The Destructive Effect of Chitinase Activities produced by Lecanicillium psalloitae CFCC84958 on Meloidogyne incognita
eggs
Student majoring in Plant Protection XXXX
Tutor XXX
Abstract: The eggshells of Meloidogyne spp. are mainly composed of chitin and protein. The chitinase activity of fungi which parasitize eggs or produce toxins for Meloidogyne spp. is one of the most important biochemical characters. It is used for evaluating the biocontrol potential of nematophagous fungi. The endochitinase and exodchitinase of Lecanicillium psalloitae CFCC84958were tested with NAG andpNP.The maximum activity of endochitinase was 3.98 μmol/h ml during4d-6d and the activity of exodchitinase was 0.26μmol/h ml at the 4 d. The results showed that L.psalloitae CFCC84958 had high chitinase activity. After 7 days of incubation with the chitinase produced by L.psalloitae CFCC84958, rates of hatching inhibitory and destruction of eg gs achieved 94.52% and 84.32%, respectively. Microscopic observations demonstrated that the eggshell of Meloidogyne spp. was deformed and destroyed. The reseach indicated that chitinase produced by L. psalloitae CFCC84958 caused the lysis of Meloidogyne spp. eggshells and resulted in the inhibition of egg hatching i n vitro.
Key words : Meloidogyne spp. ; Lecanicillium psalloitae; Chitinases；egg destruction; egg hatching
引言
根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物根系定居性内寄生物, 繁殖力强、适应性强,是当前我国主要的农作物病原线虫之一。

据Sasser & Freekman报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元,其中根结线虫(Meloidogyne spp.)每年对世界上经济作物造成高达数百亿美元的损失。

从世界范围内看，根结线虫为害其寄主作物的损失率约10%，发生严重的田块损失达50%-70%以上，个别地块甚至整个植株死亡。

迄今已报道的根结线虫达80余种, 其中有4个种,即南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)及北方根结线虫(M.hapla)发生较为普遍，它们造成的经济损失占整个根结线虫所引起的农作物损失的90%以上[1]。

由根结线虫为害植物根系所引起的根结线虫病是一种世界性分布的土传病害,给许多国家的农林和园艺等产业造成巨大损失。

近年来我国由于根结线虫的危害给农业生产上造成了严重损失，特别是保护地蔬菜、烟草和花生等作物。

根结线虫病害防治的难题是目前农业生产上亟待解决的问题。

根结线虫病害传统主要采用化学杀线剂、轮作和使用抗病品种等措施进行防治，但这些防治措施都有其局限性。

化学杀线剂的长期和广泛使用，使土壤和植物产品农药残留、资源浪费和环境污染等问题日益突出，以及对人畜的不安全等，化学杀线剂已经或即将被禁用。

如非熏蒸性化学杀线剂如涕灭威、克线磷等对于土壤和植物产品的残留毒性，以及对人畜不安全，已被禁用；熏蒸性化学杀线剂如溴甲烷（Methyl bromide）虽然对土壤的残留毒性不高，但它严重破坏大气层中的臭氧层，在世界范围内至多能够应用到2010年（Ristaine & Thomas,1997）[2]。

非寄主植物轮作措施因根结线虫的寄主范围广而遇到困难，在一些种植区，特别是蔬菜种植区很难实行。

加之当前广泛种植的茄科和葫芦科蔬菜尚无生产上大面积使用的抗根结线虫品种。

寻找替代防治根结线虫病害安全有效的防治策略,这些措施必须具备无公害可持续农业生产的要求。

主要包括应用土壤有机添加剂、植物源杀线物质以及引进生物防治因子等，调控栽培土壤中的微生态环境，使失衡的微生态环境得以逐渐恢复，创造和诱导土壤的抑线性。

生物防治具有可持续发展及保持生物多样性的优势。

采用生物防治对根结线虫病害的治理已上升为国内外研究和应用的热点，也是根结线虫病害可持续治理的理想途径之一。

生物防治是指将有效的线虫天敌微生物活体引入释放至土壤控制线虫危害，引入生物防治是目前植物病虫害生物防治的主要方式。

生物防治的主要目标是增加土壤中线虫天敌的数量，来减少土壤中的线虫密度[3]。

从植物病害生物防治的角度讲，在根际处生存的某些微生物为植物根系免受病原物的侵染提供了最前沿的防线，因此这类生物作为生物防治因子使用很理想。

植物病原线虫是农业生产上一类重要的病原物，在分类学和生态学上具有丰富的多样性。

在自然界中线虫的天敌生物种类很多，包括真菌、细菌、病毒、昆虫和螨类、原生动物、节肢动物、捕食性线虫和立克次氏体属的微生物等，其中真菌防治线虫病害是研究和应用最活跃的领域之一，这方面的研究取得了可喜的进展。

刀孢蜡蚧菌(Lecanicillium psalliotae)早先被归为刀孢轮枝菌Verticillium psalliotae（Treschow,1941），后来根据形态学特征及ITS序列比较分析，Gams和Zare在2001年将蜡蚧菌从轮枝菌属中划分出来，建立蜡蚧属(Lecanillium)。

分生孢子以直角成簇的着生在瓶梗顶端；瓶梗较纤细；菌丝产生晶体，多为八面体；没有发现产生厚垣孢子。

蜡蚧属现有15个种。

蜡蚧菌最早由Nivter于1861年在斯里兰卡首次发现,是咖啡蜡蚧( Lecacii coffeae)的寄生菌。

目前,西欧、苏、美等许多国家对该菌已有广泛深入的研究, 并已用于害虫的生物防治。

在我国,蜡蚧菌于1959年台湾曾有记载,此后贵州、广州、湖南、北京等相继发现该菌寄生于蚧类、蚜类、蛾类、步行虫等昆虫。

蜡蚧菌在世界上广泛分布，寄生于昆虫。

该菌对于线虫的生物防治研究，国内未见报道
[4]。

蜡蚧菌的寄主范围广, 能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱, 还可寄生鳞翅目的一些害虫、蓟马及线虫等。

蜡蚧菌较多的作为昆虫生防菌被研究，利用昆虫病原真菌流行病的发生可自然制约害虫的种群数量维护生态平衡减少化学农药的用量因而降低防治成本减少环境污染。

20世纪70年代以来，欧洲一些国家及美国、日本等国对利用刀孢蜡蚧菌防治温室蔬菜害虫给予极大重视。

刀孢蜡蚧菌的主要形态特征：该菌菌落在PDA培养基上27℃，10天直径可达24-47mm，白色，棉状，菌丝很少簇生；背面红色或紫红色；气丝无色，有隔,自匍匐气丝上伸出锥形瓶梗，单生或3-4（或6）根轮生，通常在菌丝未分化的末端长出的瓶梗数常较多,通常大小为25-35×1.0-1.5µm,基部较粗至尖端逐渐变细，有时产生次生菌丝;初生分生孢子镰刀形，随后出现的孢子通常为卵圆或椭圆形，镰刀形的大分生孢子弯曲，一般具有尖锐的末端，具有一个隔，少数具有两个隔，大小为5-10×1.2-1.7µm。

随后出现小分生孢子卵圆形的大小为2.7-3.7×1-1.5。

该菌产生八面体的晶体。

最适生长温度：21～24（-27）℃(24-38mm diam.)，33℃不生长。

相对湿度对蜡蚧菌分生孢子萌发影响很大，当相对湿度低于75%时，该菌的分生孢子不能萌发。

该菌的有性型至今还没有被发现(Gams,1971,Brady,1979)[5]。

刀孢蜡蚧菌能够产生几丁质酶，由于线虫卵壳中含有几丁质（40%左右），几丁质酶对线虫卵的存活和发育产生影响。

几丁质是一种不溶解N-乙酰葡萄糖胺的β-1,4-联聚合物，是自然界中第二丰富的碳水化合物聚合物。

几丁质可以被双酶系统降解，其中包括一种几丁质内切酶及几丁质外切酶。

降解发生在两个连续的步骤:首先水解酶,成为低聚物(主要是二聚体)，然后几丁质外切酶将其降解成N-乙酰葡萄糖胺单体[6]。

几丁质酶是一种分解几丁质的水解酶，这些酶广泛分布于自然界，并已在细菌、真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物上被发现。

刀孢蜡蚧菌为机会和产毒真菌，机会真菌能定殖于球形胞囊线虫
( Globodera spp. ) 、胞囊线虫( Heterodera spp. )和根结线虫(Meloidogyne spp. )等固定性内寄生线虫的繁殖体上 ,这类真菌能侵染根内和根表以及土壤中的繁殖体[7]。

Galper等报道, Cuninghamella elegans可以产生胶原蛋白酶,
这种真菌在胶原蛋白培养基上的培养滤液可以抑制爪哇根结线虫卵的孵化影响幼虫的活动和侵入[8]。

这类真菌并不明显地寄生胞囊线虫,但它们可以定殖于胞囊上利用胞囊内的营养物生长,同时产生多种酶抑制卵的孵化。

蜡蚧菌是一种非专化的机会性真菌种类，能够通过竞争作用来获取土壤中包括线虫在内的许多营养基质。

目前，根结线虫病的生物防治已经成为一种趋势，受到越来越多的关注。

筛选高效菌株和对已有作为生防资源的机会真菌的潜力研究是国内外线虫学者共同努力的方向。

通过研究发现，蜡蚧菌作为生防菌株具有明显的优势。

高效产生几丁质酶能力是筛选植物病原线虫卵寄生真菌的重要指标之一[9]。

筛选高效产生几丁质酶活性、产酶条件和对线虫卵的作用机制的研究具有重要意义。

本试验应用相同来源的刀孢蜡蚧菌，测定在不同的外界条件下（如温度、PH 等）其在诱导液体培养基内产生几丁质酶的规律。

测定产生几丁质酶系高峰期刀孢蜡蚧菌的培养滤液对南方根结线虫卵的影响，为进一步筛选菌系和研制菌剂添加成分提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试菌株
山东青岛城阳丝瓜根结线虫卵的卵寄生真菌刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae CFCC84958，保存于青岛农业大学线虫学研究室。

1.2 供试试剂
几丁质酶活性测定所用试剂：胶体几丁质（colloidal chitin）、Schales’液、NAG、 pNP-NAG、pNP
1.3 产几丁质酶培养条件
250mL的锥形瓶内盛有120mL的液体培养基(0.2%胶体几丁质, 0.1% KH
2PO
4
，
0.03% NaCl, 0.001%FeSO
4，0.3%KNO
3
，0.03% MgSO
4
•7H
2
O和0.3%
Tryptone(Sigma) ,）调pH值为5.5。

0.15MPa,121℃灭菌30min备用。

将在PDA平板上活化7d的蜡蚧菌菌落边缘菌块(直径6mm)接种于含120mL 几丁质液体培养基的250mL锥形瓶中，每瓶放菌块3个，置于摇床25℃150r/min 培养，3次重复。

从第0d到第14d，取1.5mL培养滤液，11000 r/min离心15min，上清液-20℃保存，供几丁质降解酶测定，隔天取样一次。

1.4 几丁质酶活性测定
1.4.1 几丁质降解酶系活性测定
几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG ，N-acetyglucosamine)含量测定。

酶促反应体系包括：0.1mL 菌培养滤液、0.5mL 1.0% 胶体几丁质和 0.4mL 0.1mol/L pH4.5磷酸钠缓冲液，3次重复，以加200μl 1mol/L NaOH 不反应为对照。

置于摇床中37℃，150r/min 反应2h ，反应后立即加200μl 1mol/L NaOH 终止反应，11000r/min 离心10min ，分别取上清液500μl 于1mL Schales’液，沸水中显色反应15min ，420nm 波长测其吸光度(OD 值)。

标准曲线以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0-100μg)制作，1个酶活单位(U)以1h 产生1μmol NAG 量计算。

1.4.2 N-乙酰葡萄糖胺(NAG)标准曲线
以5μmol/mL 稀释5倍后，作为母液，按表1测定其吸光度A 420，做标准
曲线(图1)。

表 1 测定几丁质降解酶活性的标准曲线的制备
Table 1 The standard curve preparation for determining chitinase activity
1.4.3 几丁质外切酶活性测定
NAG 含量(μmol)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 1μmol/mlNAG(μl)
0 50 100 150 200 250 300 350 H 2O(μl)
500 450 400 350 300 250 200 150 Schales’液(μl)
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 ΔA(420nm)
0 0.134 0.269 0.408 0.551 0.681 0.814 0.934
几丁质外切酶（N-acety-β-D-glucosaminidase）活性测定以pNP-NAG为底物，测定酶促反应生成的对硝基苯酚（pNP，ρ-nitrophenol）的含量。

酶促反应体系包括：50μl菌培养滤液、50μl pNP-NAG(1mg/mL)、100μL 0.1mol/L pH5.0醋酸缓冲液，3次重复，以加1mL 1mol/L NaOH不反应为对照。

置于摇床中37℃，150r/min反应2h，反应后立即加1mL 1mol/L NaOH 终止反应。

混匀后立即在405nm 下测量其吸光度（OD值）。

标准曲线以已知含量对硝基苯酚（pNP）制作，1个酶活单位（U）以1h产生1μmol pNP量计算。

1.4.4 对硝基苯酚（pNP，p-nitrophenol）标准曲线
，做标准曲线（图2）。

以1μmol/mL 作为母液，按表2测定其吸光度A
405
表 2 测定几丁质外切酶活性的标准曲线的制备
Table 2 The standard curve preparation for determining exochitinase activity pNP含量（μmol） 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.00625
1μmol/mLpNP（μl） 100 50 25 12.5 6.25 H2O(μl) 0 50 75 87.5 93.75
1 M NaOH（μl）10001000 100010001000
ΔA(405nm) 1.570 0.815 0.428 0.241 0.144
1.5 刀孢蜡蚧菌产生的几丁质酶对根结线虫卵的破坏
1.5.1 根结线虫卵悬液的制备
将感染南方根结线虫的新鲜丝瓜根，经水冲去土壤后，在OLYMPUS高级解剖镜下直接解剖病根，挑出卵囊，置于含2%NaClO的小瓶中，涡旋震荡，得到卵悬浮液，制成100eggs/mL左右，待用。

1.5.2 卵孵化抑制率及破坏率的测定
将培养4d的刀孢蜡蚧菌培养滤液和根结线虫卵悬浮液（100个卵左右/mL）加入到24孔板中，将该菌株设5个浓度梯度，分别为0%，25%，50%，75%，100%，以0%做对照，4次重复，25℃培养7d（间隔2d轻微晃动以保证通气）。

定期观察卵壳变化情况，7d计量卵孵化数，计算卵孵化相对抑制率。

孵化率（%）=（Jf ×100）/ (Ei+Ji)
破坏率（%）=（（Ei-Ef）-（Jf-Ji）） / Ei
Ei表示起始成熟卵的数量；Ef表示最终剩余卵的数量；Ji表示起始2龄幼虫的数量；Jf表示孵化2龄幼虫的数量
相对抑制率（%）=（对照孵化率-处理孵化率）/对照孵化率
2 结果与分析
2.1 几丁质降解酶系活性测定的结果
在以0.2%胶体几丁质(colloidal chitin)作为主要C源和N源的半液体培养基内，在不同的温度和PH值下刀孢蜡蚧菌表现的几丁质降解酶系活性特性存在明显差异。

其中在温度为37℃、PH为4.5条件下刀孢蜡蚧菌表现的活性最强（图3），在此条件下刀孢蜡蚧菌L. psalloitae CFCC84958从第1d开始就表现出降解酶活性，酶活性上升迅速，第3d达到酶活性高峰为3.98 µmol/h ml,之后缓慢下降。

2.2 几丁质外切酶活性测定的结果
刀孢蜡蚧菌L. psalloitae CFCC84958的培养滤液也表现出外切酶活性。

从第2d 开始就产生几丁质外切酶，在第4d 达到酶活性为0.26umol/h mL ，从第8d
2.3 刀孢蜡蚧菌培养滤液对卵孵化的影响
由实验结果可知：刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae CFCC84958的几丁质酶培养滤液对根结线虫卵具有一定的孵化抑制和破坏作用。

刀孢蜡蚧菌四个浓度的几丁质酶培养滤液对根结线虫卵都具有不同程度的孵化抑制和破坏作用。

37℃下培养，该菌的培养滤液在浓度递增的情况下，对根结线虫卵孵化抑制率和破坏率随时间的增加而递增。

其中培养7d ，100%浓度的培养滤液对根结线虫卵孵化抑制率和破坏率最大。

（图5、图6）
图4刀孢蜡蚧菌培养滤液几丁质外切酶活性
Fig.4 Exochitinase activity in culture filtrate of Lecanicillium psalliotae CFCC84958
-0.100.1
0.20.30.40.5
0246810121416Time(d)e x o c h i t i n a s e a c t i v i t y (u m o l /h m l )图 5 刀孢蜡蚧菌培养滤液对根结线虫卵壳的破坏率
Fig 5 Damage rate of Lecanicillium psalliotae CFCC84958 on incubation of Meloidogyne
比较培养这7d各浓度下该菌培养滤液对根结线虫卵壳的破坏率，由图5
可知:25%浓度的培养滤液对根结线虫卵壳的破坏率最小,100%浓度的最大，最终达到84.32%。

第1d，50%、75%、100%浓度间对卵壳的破坏率差异不显著，而这三个浓度与25%浓度之间差异显著。

从3d到第7d，25%、50%、75%浓度间对卵壳的破坏率差异不显著，该三个浓度与100%浓度间差异显著，并且在第7d随滤液浓度升高破坏率也相应依次增大。

在第7d各浓度培养滤液对卵壳的破坏率均比前几天大，由此可知培养滤液浓度越高，培养时间越长对卵壳的破坏效果越明显。

说明该菌的培养滤液对南方根结线虫卵孵化具有破坏作用。

图6 刀孢蜡蚧菌培养滤液对根结线虫卵孵化的抑制率
Fig 6 Inhibition rate of Lecanicillium psalliotae CFCC84958 on incubation of
Meloidogyne incognita eggs
比较培养这7d各浓度下该菌培养滤液对根结线虫卵孵化的抑制率，由图6可知，25%浓度的培养滤液对根结线虫卵孵化的抑制率最小,100%浓度的最大，最终达到。

第1d，25%、50%浓度间对根结线虫卵孵化的抑制率差异不显著，而这
两个浓度与75%、100%浓度间都差异显著，75%与100%浓度间差异显著。

从第3d 到第7d,25%、50%、75%三种浓度对卵孵化的抑制率持续升高并且差异显著，而100%浓度的培养液对卵孵化的抑制率则几乎没变，但从这7d总体来看，卵孵化抑制率是持续升高的，说明培养滤液浓度越高，培养时间越长对卵孵化的抑制效果越明显。

说明该菌的培养滤液对南方根结线虫卵的孵化有抑制作用。

2.4 南方根结线虫卵壳的形态变化
由显微镜下观察的图片可知根结线虫卵壳有不同程度的变化。

第1d Lecanicillium psalliotae CFCC84958处理的卵壳有稍微的缢缩；3d后可以看到菌株Lecanicillium psalliotae CFCC84958处理的卵内含物聚集，卵壳变空，对照可以清晰的看到卵内的1龄幼虫。

7d后，该菌株培养滤液处理的卵壳能看到卵的变形和破损，对照能看到孵化的2龄幼虫。

2.5 结论
刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae CFCC84958能够产生几丁质酶，其培养滤液对根结线虫的卵具有抑制孵化和破坏作用。

在温度为37℃、PH 为4.5条件下刀孢蜡蚧菌表现的活性最强。

在适宜的外界条件下（如温度、PH 、培养天数等），该菌的培养滤液对根结线虫卵的抑制孵化和破坏作用随浓度的增高而增大，100%浓度的培养滤液对根结线虫卵的孵化抑制率和破坏率最大。

3 讨论与展望
3.1 讨论
根结线虫卵寄生真菌对根结线虫病害生物防治具有很大潜力[10]。

筛选对根结线虫卵具有高效生物防治活性微生物是生物防治的基础。

几丁质酶在卵寄生真菌图
7 刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae CFCC84958对卵孵化率的影响
A.水处理；
B. CFCC84958菌培养滤液
A1,B1.第1天的卵；A2,B2.第3天的卵；A3,B3.第7天的卵
Fig 7 Effect of Lecanicillium psalliotae CFCC84958 on morphology of Meloidogyne
incognita eggs
A. Water;
B. CFCC84958
A1,B1.M.incognita eggs on the first day;A2,B2. M.incognita eggs on the third day;
A3,B3. M.incognita eggs on the seventh day
穿透线虫卵壳的寄生机制中起着关键作用，特别是寄主细胞结构中含有几丁质成份，线虫卵壳中的几丁质层位于卵壳的中部，为
50-400nm厚的结构，是卵寄生真菌侵入卵的过程中最难穿透的屏障[2/6]。

分离自胞囊类和根结线虫卵寄生真菌约一半种类具有产生几丁质降解酶系活性[11]，产生几丁质降解酶系活性的强弱与抑制根结线虫卵孵化率呈正相关[1/8,1/9]。

表明几丁质降解酶系活性的强弱是筛选和评价线虫卵寄生或产毒真菌生物防治潜力的重要指标之一。

3.2 展望
3.2.1 安全性评价
随着人们风险分析意识的增强，人为获得的抗药性线虫生防菌释放到环境后，很可能给生态环境中其他生物群体包括微生物、植物、动物群体，包括人带来潜在风险，可能成为新的有害生物[12]。

因此，务必在释放前进行全面深入地风险分析与安全性评价。

在线虫的生防中，大多数的生防真菌对人类的健康是没有威胁的，但淡紫拟青霉（P.lilacinus）却是个例外[13]。

该种生防菌对哺乳动物具有一定的毒性，它除能侵染人的眼睛，引起人面部发生病变外，也能对家畜进行侵染，尤其是在哺乳动物的眼睛受到生理胁迫、或在侵染前受到伤害、或由于先前的外科手术使组织衰弱时，上述情况就比较容易发生[13/14]。

有鉴于此，在对生防因子正式施用到环境中或在使用前必须对它们进行测试，以保证它们的施用不会对人类健康和其它非靶标生物的生存造成威胁。

3.2.2 根结线虫生物防治展望
生物防治是植物寄生线虫的一项重要防治措施，因其符合现代环保与健康理念，受到普遍重视。

但离大规模应用还有距离，还有许多需加强的基础研究和亟待解决的问题：一、进一步开展线虫天敌资源的种类调查与高效菌株筛选；二、加强对线虫种群动态及天敌动态模型的研究，加强生防菌定殖、消长规律及土壤抑菌作用等生态学问题研究；三、对生防资源进行风险性评价；四、解决剂型研制是生防菌剂商品化的难点[15]。

分子生物学技术在生防中具有广阔的应用前景，尤其是在线虫生防资源调查、高效生防菌株的选育、基因改良、菌剂研制、抗病育种，以及线虫与植物的相互作用等研究领域中的应用。

植物寄生线虫的生物防治仍需要广泛深入研究，随着研究的不断深入，线虫的生防必将取得长足的发展和辉煌的成就。

根结线虫病的防治虽然取得了较大进展，但也存在一定的问题。

主要表现在综合防治的意识淡薄，片面强调化学农药的重要性，忽视了其它防治措施的合理运用；单一作物连作、复种指数高，或化肥的不合理施用，导致根结线虫病的发生呈逐年加重的趋势；到目前为止，国内外形成商品化生产并广泛应用于大田的线虫生防制剂甚少。

因此，根结线虫病的综合防治依然任重道远。

随着科学技术的进步，综合防治的概念必定得到普及和认同。

同时分子生物学、细胞遗传学等手段，势必使抗病育种研究工作取得新的突破。

基因工程技术也在为生物性杀线虫剂的研发与生产提供着强有力的技术支持。

在不久的将来，以化学农药为主要防治手段的传统措施必将被以各种防治手段并重的新型综合防治体系所取代。

在世界各国科学工作者的不懈努力下，根结线虫的生物防治工作已经取得了一定的进展，呈现出较好的发展趋势。

根结线虫生物防治天敌资源在世界不同国家和地区被广泛调查和筛选，目前至少已有6个用于防治根结线虫的商品化制剂[15]。

特别值得一提的是，在国内几家单位的长期合作研究下，我国在根结线虫生物防治领域取得了重要的进展，已开发出国内唯一的线虫生防商品制剂，并获多项发明专利。

随着人们对根结线虫、寄主植物和生防资源之间生物学和生态学知识的不断积累和理解，根结线虫生物防治必将取得更大的突破。

致谢：
本论文是在XX的悉心指导下完成的。

在实习期间，XXX不但在学习上耐心的指导，而且在生活上给予无微不至的关怀，尤其是XX严谨的治学态度、渊博的专业知识、为人师表、无私奉献的精神令我终生难忘。

他不但教会我如何学习，也教会我如何做人。

在此我向XXX表示衷心的感谢，感谢他们无私的指导、严格的要求、热忱的鼓励和亲切的关怀！
在论文的整理和写作过程中，得到了XX还有XXX同学等多人的大力支持和帮助。

同时在这四年的学习和生活上，学院和学校的各位领导和老师都给予我大力的支持和帮助。

在此表示忠心的感谢！
参考文献:
[1] Sasser J N, Freekman D W. A world perspective on nematology:the role of the
society[J]. In:Veech J A,Dickerson D W. Vistas on Hematology. Society of Hematologist, 1987, 7-14.
[2] Barker K R, Townshend J L, Bird G W et al.. In: Method for evaluating pesticides
for control of plant pathogens (Hickey K D, eds) [J]. St. Paul, MN: APS Press,1986, 283-296.
[3] Kiewnick S, Sikora R A. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne
incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251[J]. Biological Control, 2006, 38:179-187.
[4] Williamson V M, Gleason C A. Plant-nematode interaction[J]. Current Opinion in
Plant Biology, 2003, 6:327-333.
[5] Medina-Filho H P, Stevens M A. Tomato breeding for nematode resistance: suivey
of resistant varities for horticultural characteristics and genotype of acid phosphatases[J]. Acta Horticulturae, 1980, 100: 383-3931.
[6] Kim J I, Choi D R. Influence of plant parasite nematodes in occurrence of
Phytophthora blight on hot pepper and sesame [J] . Research Reports of the Rural Development Administration, Cropprotection, Korea Republic, 1989, 31 (1) : 27-
30.
[7] Fernandez C, Rodriguez-Kabana R, Warrior P, Kloepper JW. Induced soil
suppressiveness to a root -knot nematode species by a nematicide. Biological Control, 2001, 22:103-114.
[8] Sorribas F J, Ornat C, Galeano M, Verdejo-Lucas S. Evaluation of a native and
introduced isolate of Pochonia chlamydosporium against Meloidogyne javania[J].
Biocontrol Science and Technology, 2003, 13:707-714.
[9] Mankau R. Biological control of nematode pests by natural enemics[J]. Ann. Rev.
Phytopathol, 1980,18:415-440.
[10] 韩生成, 刘清利, 孟颂东等. 植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究
进展.农业生物技术学报[J], 1999, 7 (4) : 47-52.
[11] Culbreath AK, Rodriguez-Kabana R, Morgan-Ones C. The use of hemicellulosic
waste matter for reduction of the phytotoxic effects of chitin and control of root-knot nematode[J]. Nematropica, 1985, 15:49-75.。