精子质量评价

精子质量评价规程

一、原理与意义

精子活力、精子存活率和精子计数是评价精子质量的三个主要指标。剖杀雄性动物，取单侧附睾，在预热的培养液中剪碎，孵育一定时间后，进行各项指标检测。精子活力：先计数a级（快直线运动，≧25um/s，即大于5个精子头）和b级(慢直线运动，5～24 um/s，即小于5个精子头)，再计数c级（原地打转或运动迟缓，≦5um/s）和d级（无活力）用血球计数板进行精子计数。精子存活率：用伊红染液和精子悬液混匀后，观察活精子（头部白色）和死精子（头部红色）分别所占比例。精子计数：用精子固定液和精子悬液混匀后，观察红细胞计数区域（25格，每格含有16小格）至少5大格（周边4格＋中间1格）的精子总数。

二、试剂及其配制

1、含0.1％BSA (小牛血清蛋白)的F12培养液（4 ℃保存，用前限量预热，当日现配,无菌操作,当变色后不可再用）。

2、精子固定液（50 g NaHCO3＋36～40%甲醛溶于双蒸水至1000 ml，4 ℃保存）

3、0.67％伊红染液（0.67 g伊红＋0.9 g NaCl溶于100 ml双蒸水，常温下保存，用前限量预热）。

三、仪器设备

光学显微镜、血细胞计数板、计数器、定时器、擦镜纸、纱布、盖玻片(20 mm×20 mm)、载玻片、水浴锅、剪刀、镊子、一次性吸管、离心管、移液器、枪头等。

四、操作步骤

本实验分为三个部分：精子活力、精子存活率、精子计数。这三个部分要按一定时间顺序操作。

操作顺序：杀死动物，取下单侧附睾（快速）→放入37 ℃预热的含3 ml F12培养液的小烧杯中，剪碎（精子充分释放）→ 37 ℃孵育5min后，精子计数检查→再加入2 mlF12 培养液，37 ℃再孵育5 min后，精子活力检查→同时再孵育5min～10min （可调整）立刻进行精子存活率检查。

具体操作：

1、精子计数检查

（1）取单侧附睾，放入预热的含3 ml F12培养液的小烧杯中，剪碎；

（2）37 ℃孵育5 min后，用剪头的一次性吸管充分将烧杯内液体混匀（重要），在小管中按1:1加入50 ul精子悬液和50 ul精子固定液，充分混匀；

（3）加6 ul入计数池一侧，将计数板放入湿盒中10 min（可调整）；

（4）在16×10倍镜下，红细胞计数区域（25格，每格含有16小格）至少观察5大格（周边4格＋中间1格）。其中，精子头部在双线最左和最上处计数，而精子头部在双线最右和最下处不计。只有精子头部没有尾部计，只有精子尾部没有头部不计。

2、精子活力检查

（1）精子计数取出50 ul精子悬液后，再在烧杯中加入2 mlF12培养液，37 ℃再孵育

5 min，用吸管充分混匀后，加

6 ul入预热计数池一侧;

（2）立即在16×10倍镜下观察，在白细胞计数区域（红细胞计数区外围，分四个区，每区12格）任选九格（刚好在镜下包括的视野）迅速计数，先计数a级（快直线运动，≧25um/s，即大于5个精子头）和b级(慢直线运动，5～24 um/s，即小于5个精子头)；再计数c级（原地打转或运动迟缓，≦5 um/s）和d级（无活力）。

3、精子存活率检查

（1）精子活力取出6 ul精子悬液后，再孵育5 min～10 min（时间可调整）；

（2）在载玻片上加入预热的0.67％伊红染液6 ul，再加入6 ul精子悬液，在玻片上用移液器混匀；

（3）盖上盖玻片，快速读片，可在高倍镜40×16倍镜下同时计数死/活精子。白色的为活精子，红色的为死精子。

五、结果计算与评价

1、精子计数检查

红细胞计数板上最小的方格=1/4000 mm3，1 mL=103 mm3

最终检测红细胞计数板五个大方格，每个大方格含16个小方格，共计数80个小方格。则：两侧附睾总精子数为（个/ml）=4×106×（五格精子数/80）×2（两侧附睾）

2、精子活动力检查

记录a级、b级、c级和d级的数目，分别计算(a+b+c)/(a+b+c+d)和a/(a+b+c+d)的值。

3、精子存活率检查

记录死精子和活精子的数目，计算活精子/（活精子+死精子）的值。

六、注意事项

1、本实验采用盲法。参与读片的人员在实验过程中不能知道实验动物的分组情况，否

则会对实验有主观性的影响。

2、培养液即用即配。如果颜色发生改变和出现絮状物，即要弃去。

3、操作要快。如取附睾、活力的读数和存活率的读片等。

4、制片：一定要将精子悬液和混合液充分混匀，再从中吸出，吸取时尽量不要吸到组织碎片。

5、各项指标均由两人平行读片：同一样品分别制备两份不同的片子，随后可以取均数统

计，若发现制片不均匀则需重新制片。这可避免读数误差和制片误差。

6、精子活力：特别是a和b都应该快速读数，一定要最短时间内读完，从第一个格开始

到第二格一直到最后的格子，读每格的时间应该固定，每读到下一格上一格通过的精子数都不要再计数，若为两人读片应该统一标准。应选择精子数较为平均的视野，如果有一两个成团的精子，则避开不数，如果成团多而大影响读数，则应该重新制片。

7、精子存活率：可由计数活力的人员来读片，刚好可在活动力读完后立刻计数。应选择

不同的视野看片，同时计数红白精子。数到红白总和超过200个就可，也可增加计数总和，但不可时间过长，否则白精子会迅速减少，所以要控制数片时间，两人可以统一标准。

8、精子计数：镜下精子应该均匀分布，若有精子成团现象要重新制片，如果精子数过少

可以增加数片格数。两人或多人读片时如果两片子读片差异过大，则应该重新制片。

9、读片时畸形精子不数。

（宁萑）

1. Bjordahl L,Barratt CL,Fraser LR,Kuist U and Mortimer D . (2002) ESHRE basic semen analysis courses