色谱的定性与定量

色谱图术语：
色谱图（chromatogram）--色谱柱流出物 通过检测器系统时所产生的响应信号对时 间或流动相流出体积的曲线图。 色谱峰（peak）--色谱柱流出组分流经检 测器系统时产生的响应信号的微分曲线。 流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似 于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲 线）。不对称色谱峰有两种：前延峰 （leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。
在LC-MS定性分析中, MS的电离方式往往 与接口有关。目前，很少使用标准的EI电 离源。所以LC-MS得到的质谱图不能使用 目前所有的标准质谱图去比对，而是要根 据其电离机理去解析得到的质谱图，这使 得LC-MS中质谱图解析比GC-MS复杂得多。
三、其他定性方法
化学衍生化法定性： 利用样品中某些化合物与特征试剂在色 谱柱前或柱后进行化学反应，生成相应的 衍生物进行定性分析的方法。这一方法特 别适用与官能团的定性。 例如：酮类化合物与2，4-二硝基苯肼反 应，生成橙黄色沉淀。因此在样品中加入 2，4-二硝基苯肼后，色谱峰消失的组分就 是酮类化合物。
1、利用保留值定性 在色谱分析中利用保留值定性是最基本的 定性方法，其基本依据是：两个相同的物 质在相同的色谱条件下应该有相同的保留 值。
利用已知物直接对照进行定性分析。利用 已知物直接对照法是目前一种最简单的定 性方法，在具有已知标准物质的情况下常 使用此法。 将未知物和已知的标准物 质在同一根色谱柱上，在相同的色谱条件 下进行分析，将色谱图进行对照比较。当 未知峰的保留值（保留时间或保留体积） 与已知标准物质的保留值完全相同时，则 未知峰可能与标准物质是同一物质。
（三）按固定相的形式 1. 柱色谱法（column chromatography ）： 固定相装在柱中 , 试样沿着一个方向移动而 进行分离。包括 填充柱色谱法：固定相填充满玻 璃管和金属管中 开管柱色谱法：固定相固定在细管内壁（毛 细管柱色谱法） 2. 平板色谱法 （planer chromatography ）： 固定相呈平面状的色谱法。 包括纸色谱法：以吸附水分的滤纸作固定 相； 薄层色谱法：以涂敷在玻璃板上的吸附剂作 固定相。
液相色谱仪中的二极管阵列检测器，除了 比较保留时间外，可以比较紫外光谱图， 如果保留时间一样，两者的紫外光谱图也 完全一样，则可基本确认两者是同一物 质，如果如果保留时间一样，两者的紫外 光谱图有较大差别，则两者不是同一物质。 利用二极管阵列检测器三维图谱比较对照 的方法大大提高了保留值比较定性方法的 准确性。
峰面积和峰高是色谱图上的最基本数据， 它们的测量精度直接影响定量分析的结果。 因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动 的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较 峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面 积进行定量分析。
2、定量方法
色谱中常用的定量方法有归一化法、外标 法、内标法和标准加入法。按测量参数又 可将上述四种定量方法分为峰面积法和峰 高法。
（2）外标法：所有定量分析中最通用的一 种简便、快速的定量方法。 直接比较法（单点校正法）： 将未知样品 中某一物质的峰面积与该物质的标准品的 峰面积直接比较进行定量。通常要求标准 品的浓度与被测组分浓度接近，以减小定 量误差。直接比较法（单点校正法）实际 是利用原点作为标准工作曲线上的另一个 点，因此，当方法存在系统误差时（即标 准工作曲线不通过原点），此法误差较大。
（二）按分离原理分 1. 吸附色谱法（ adsorption chromatography ）： 根据吸附剂表面对不同组分物理吸附能力的强 弱差异进行分离的方法。 如：气一固色谱法、液-固色谱法——吸附色谱 2. 分配色法 （partition chromatography ）： 根据不同组分在固定相中的溶解能力和在两相 间分配系数的差异进行分离的方法。 如：气-液色谱法、液-液色谱法——分配色谱
确认方式： 当改变色谱柱或改变流动相的组成时，未 知峰的保留值与已知标准物质的保留值仍 能完全相同时，则可以基本上确认未知峰 与标准物是同一种物质； 将已知标准物加入到未知样品中，若使未 知峰的峰高增高，则也可以基本上确认未 知峰与标准物是同一种物质。注意：加标 时应尽量等量加入，以防止加入量太小， 峰高变化小，看不出来，加入量过大，将 原色谱峰覆盖； （画图讲解）
三、术语
色谱定性与定量是色谱分析的两个最主要 的目的，就是要对被分析样品中的未知组 分进行定性和定量、对已知组分进行定量。 各种模式的色谱分类机理与方法有很大差 异，但其定性和定量的依据和方法却是大 同小异。
从不同类型的色谱方法中得到的色谱图上 可以得到一些相似的信息（数据）。通过 对这些信息（数据）的处理，可以得到所 需的定性、定量结果。基本信息包括每一 张色谱图上可以得到每个色谱峰的流出时 间（或出峰时流动相流出体积）和该色谱 峰在检测器上的响应强度。
2、色谱-质谱联机定性
质谱:样品分子在离子源内被电离，产生各 种各样的离子。这些离子经过质量分析器 （如离子阱质量分析器、四极杆质量分析 器、飞行时间质量分析器等）后，按其质 荷比m/z（即离子质量与其所带电荷的比值） 分离，分离后的离子依次被检测器检测， 其响应强度被记录下来，形成一个按离子 质荷比大小排列的响应强度谱，称为质谱。
基线漂移—基线随时间定向的缓慢变化。 产生原因：电源电压不稳、色谱系统未达 到平衡、固定相流失、流动相的变化、温 度和流量的波动。
二、定性分析
定性分析是要确定样品中的一些未知组 分是什么物质，在色谱分析中就是要确 定色谱图中一些未知的色谱峰是什么物 质。色谱分析中的定性主要是依据特征 性不是很强的保留值，这需要和已知的 标准物质的保留值进行比对。
色谱的定性与定量
北京市海淀区产品质量监督检验所 国家食品质量安全监督检验中心 刘艳琴 中心副主任 高级工程师
2009年1月12日 年 月 日
一、概述
1、定义 色谱法：利用混合物中各物质在两相间分 配系数的差别，当溶质在两相间做相对移 动时，各物质在两相间进行多次分配，从 而使各组分得到分离。
二. 色谱法分类 （一）按两相物理状态分 1. 气相色谱法 (gas chromatography 简称 GC) 用气体作流动相的色谱法。 2. 液相色谱法 (liquid chromatography 简称 LC) 用液体作流动相的色谱法。 3. 超临界流体色谱法 (SFC) 用超临界状态的流体作流动相的色谱法。超临 界状态的流体不是一般的气体或流体 , 而是临界压 力和临界温度以上高度压缩的气体 , 其密度比一般 气体大得多而与液体相似 , 故又称为 “ 高密度气相色谱法 ”
（3）内标法 内标法是将已知浓度的标准物质（内 标物）加入到未知样品中去，然后比较内 标物和被测组分的峰面积，从而确定被测 组分的浓度。
（1）归一化法：将所有出峰的组分含量之 和按100%计的定量方法。 归一化法是将所有组分的峰面积分别乘以 它们的相对校正因子后求和，即所谓“归 一”，被测组分X的含量可以用下式求得： 式中Ai-组分i峰面积 fi-组分的相对校正因子
采用归一化法进行定量分析的前提条件是 样品中所有成分都要能从色谱柱上洗脱下 来，并能被检测器检测。归一法主要在气 相色谱中应用。归一化法简便，准确，进 样量多少不影响定量的准确性，操作条件 的变动对结果的影响也较小，尤其适用多 组分的同时测定。但若试样中有的组分不 能出峰，则不能采用此法。
表示方式： 1、将离子质荷比和其响应强度的相对值按 质荷比大小排成图表表示； 2、棒图：将离子质荷比作为横坐标，响应 强度作为纵坐标，作出按离子质荷比大小 排列的棒图，每一根棒在纵坐标上的大小 表示该质荷比的离子在检测器上响应值的 大小。
定性分析：如果未知物的质量色谱峰保留 时间与标准物一致，未知物中的两个子离 子的相对丰度与浓度相当的标准物质的相 对丰度一致，定性离子相对丰度的最大偏 差不超过表1的规定，则可判定未知物与标 准物是同一种物质。
假峰 ghost peak—并非由试样所产生的峰。 畸峰 distorted peak—形状不对称的峰，如 拖尾峰、前伸峰。 基线（baseline）--在正常操作条件下，仅 有流动相通过检测器系统时产生的响应信 号的曲线。
基线噪音线波动。噪声分为长噪音和 短噪音：短噪音来自仪器的电子系统和泵 的脉冲。长噪音来自检测器本身组件不稳 定或溶剂不纯，温度、流动相的波动。 （通常因电源接触不良或瞬时过载、检测 器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污 染等所致。）
3. 离子交换色谱法 （ion exchange chromatography ） 根据不同组分离子对固定相亲和力的差异进行 分离的方法。 4. 排阻色谱法（ size exclusion chromatography） 又称凝胶色谱法 （gel chromatography ）, 根据不同组分的分子体积大小的差异进行分离 的方法。其中：以水溶液作流动相的称为凝胶过 滤色谱法 ；以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透 色谱法。 5. 亲合色谱法 (affinity chromatography) 利用不同组分与固定相共价键合的高专属反应 进行分离的方法。
多种方法配合定性：任何一种定性方法都 有一定的局限性，只有用两种或两种以上 的不同方法配合使用，才能提高色谱定性 结果的可靠程度。
三、定量分析
1、原理：定量分析是要确定样品中某一组 分的准确含量。在一定的色谱操作条件 下，流入检测器的待测组分i的含量mi（质 量或浓度）与检测器的响应信号（峰面积A 或峰高h）成正比： mi = fiAi 或 mi= fi hi 式中，fi 为定量校正因子。
标准曲线法： 将被测组分的标准物质配制 成不同浓度的标准溶液，经色谱分析后制 作一条标准曲线，即物质浓度与其峰面积 （或峰高）的关系曲线。根据样品中待测 组分的色谱峰面积（或峰高），从标准曲 线上查得相应的浓度。标准曲线的斜率与 物质的性质和检测器的特性相关，相当于 待测组分的校正因子。该方法适用于大量 样品分析。其优点是操作简便，不需要测 定校正因子，计算简单。结果的准确性主 要取决于进样的重视性和色谱操作条件的 稳定性。
表1 定性离子相对丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% >20%至50% >10%至20% ≤10% ±50%
允许的相对偏差
±20%
±25%
±30%
在GC-MS定性分析中MS分析多用EI电离 源电离，得到的MS谱图可以在标准条件下 （EI电离，电子轰击能量70eV）的MS标 准谱图进行比对，这样可以利用计算机检 索与计算机内存的标准谱图谱库中的谱图 进行比对，从而进行定性分析。在GC-MS 定性分析中，特别要注意色谱柱的流失和 溶剂中杂质的。
选择性检测器定性：当某一被测化合物同 时被两种或两种以上检测器检测时，两个 检测器或两个以上检测器检测对被测化合 物检测灵敏度比值是与被测化合物的性质 密切相关的，可以用来对被测化合物进行 定性分析。
双检测器体系的连接方式一般有串联连接 和并联连接两种。最常用于定性鉴定工作 的双检测器体系是气相色谱的FID-ECD检 测器对。还有FPD-TCD、FPD-FID等。
拖尾峰 tailing area--后沿较前沿平缓的不 对称峰。 前伸峰 leading area--前沿较后沿平缓的不 对称峰。 峰底（peak base）--从峰的起点与终点之 间的连接直线。 峰高（h ，peak height）--从峰高最大值至 峰底的距离。
峰宽 W，peak width--在峰的两侧拐点处所 作切线与峰底相交两点之间的距离。 半高峰宽 Wh/2，peak width at half height-通过峰高的中点做平行与峰底的直线，此 直线与其峰两侧相交两点间的距离。 峰面积 A，peak area--峰与峰底间的面 积，又称作响应值