CHIP技术

染色质免疫沉淀分析ChIP技术介绍染色质免疫沉淀分析ChIP 技术介绍（Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP）（Abcam 公司和Upstate 公司都提供ChIP 抗体产品）染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA 与蛋白质相互作用的重要工具。

它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。

核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。

根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP 也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。

DNA 通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。

转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。

该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。

随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。

参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。

它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。

CHIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

而且，CHIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP 与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

由此可见，随着CHIP 的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA 结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA 结合的状况。

染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

ChIP 技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。

ChIP 基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。

染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。

它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。

随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。

目前已经有成熟的ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。

因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。

对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。

抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。

建议仔细检查抗体的说明书。

特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。

多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。

为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。

另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。

即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。

抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。

缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。

它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。

核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。

根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。

DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。

转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--“组蛋白密码”，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。

该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。

随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。

参与修饰的酶根据其作用的不同而分类：如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上等不同组氨酸修饰标记对应于不同的生物学过程，它可以作为调节因子的作用位点，也可以用来改变染色质结构。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DN A相互作用的信息。

它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。

CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。

染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。

ChIP基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。

ChIP（染色质免疫沉淀）实验方法1.Cross-linking and cell harvesting1.1. Start with two confluent 150 cm2 dishes (1×107- 5×107 cells per dish).Cross-link proteins to DNA by adding formaldehyde drop-wise directly to the mediafor a final concentration of 0.75% and rotate gently at room temperature (RT) for 10min.*1.2. Add glycine to a final concentration of 125 mM to the media and incubate withshaking for 5 min at RT.1.3. Rinse cells 2 x with 10 ml cold PBS.1.4. Scrape cells into 5 ml cold PBS and transfer into 50 ml tube.1.5. Add 3ml PBS to dishes and transfer the remainder of the cells to the 50 ml tube.1.6. Centrifuge for 5 min at 1,000 g.1.7. Carefully aspirate off supernatant and resuspend pellet in FA Lysis Buffer (750μl per 1×107 cells).* When using suspension cells, start with 1×107- 5×107 cells and treat with both 0.75% formaldehydeand glycine as described above. Pellet cells by centrifugation (5 mins at 1,000 g). Wash 3 x withcold PBS and resuspend pellet in FA Lysis Buffer (750 μl per 1×107 cells). Proceed to Step 2.1.2. Sonication2.1. Sonicate lysate to shear DNA to an average fragment size of 500 to 1000 bp. This will need optimizing as different cell lines require different sonication times. Follow the fragment size on a 1.5% agarose gel.2.2. Centrifuge for 30 secs, 4°C, 8,000 g and transfer supernatant to new tube.**2.3. Remove 50 μl of each sonicated sample This sample is the INPUT, and this is used for obtaining the DNA concentration (see Step 5).**The lysed cells can be snap frozen in liquid nitrogen after and stored at -70°C for up to 2 months.Avoid multiple freeze-thawing.3. Immunoprecipitation3.1. Use approximately 25 μg of protein per IP. Protein concentration can be calculated using the Bradford assay. Dilute each sample 1:10 with RIPA Buffer. You will need one sample for the specific antibody, and one sample for the beads only control.3.2. Add the primary antibody to all samples except the beads-only control. The amount of antibody to be added has to be determined empirically, 1-10 μg of antibody per 25 μg of protein often works well.3.3. Add 20 μl of protein A/G beads (pre-absorbed with sonicated single stranded herring sperm DNA at 1.5 μg / 20 μl beads***) to all samples and IP overnight with rotation at 4°C.3.4. Centrifuge the protein A/G beads for 1min at 2,000g and remove the supernatant.3.5. Wash beads 3 x with 1ml Wash Buffer (centrifuge as above).3.6. Wash beads 1 x with 1ml Final Wash Buffer (centrifuge as above).***Preparation of protein A/G beads with single stranded herring sperm DNA- Mix an equal volume of Protein A and Protein G beads and wash 3 X in RIPA Buffer.- Aspirate RIPA Buffer and add single stranded herring sperm DNA to 75 ng/μl beads and BSA to a final concentration of 0.1 μg/μl beads. Add RIPA Buffer to twice the bead volume and incubate for 30min with rotation at 4°C.- Wash once with RIPA Buffer and add RIPA Buffer to twice the bead volume.4. Elution and reverse cross-link4.1. Elute DNA by adding 120μl of Elution Buffer to the protein A/G beads and rotate for 15 min at 30°C.4.2. Spin down and transfer the supernatant into fresh tube.**4.3. The INPUTs can be included at this stage. Add 80μI of elution buffer (when using the DNA purification kit) or 400 μl TBS (when using phenol:chloroform) to each INPUT sample. Add either 2 μl RNase A (0.5 mg/ml) when purifying DNA using PCR purification kit or 5 μl of proteinase K (20 mg/ml) when purifying DNA using Phenol:Chlorophorm to the eluates (INPUTs and IP material) and heat at 65°C for 4-5hrs (or overnight).****4.4a.The DNA is then purified using a PCR purification kit following the manufacturer’s instructions.4.4b. Alternatively the DNA can be Phenol:Chlorophorm extracted and ethanol precipitated in presence of 10μl glycogen (5 mg/ml) and taken up in 100 μl H2O.4.5. Store samples at -20°C or proceed with detection method (PCR, microarray, etc).*****4.6. PCR is used to quantify DNA levels of specific loci. This is analyzed semi-quantitatively (analyses of PCR endproduct by agarose gel) using primers which can be designed using the URL below. /bioapps/primer3_www.cgiAlternatively, DNA levels are quantitatively measured by real-time PCR. Primers and probes are often designedusing software provided with the real-time PCR apparatus.**** The samples can be frozen and stored at -20°C after these steps.***** The INPUT DNA is purified as described and the concentration should be calculated. Transfer 5 μl of the purified DNA in a tube containing 995 μl TE to give a 200-fold dilution and read the OD260. The concentration of DNA in μg/ml is OD260 x 10,000. This is used to calculate how much input DNA was included in the immunoprecipitation, and the sample values altered accordingly.SolutionsFA Lysis Buffer50 mM HEPES-KOH pH7.5140 mM NaCl1 mM EDTA pH81% Triton X-1000.1% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors (add fresh each time)RIPA Buffer50 mM Tris-HCl pH8150 mM NaCl2 mM EDTA pH81% NP-400.5% Sodium Deoxycholate0.1% SDSProtease Inhibitors (add fresh each time)Wash Buffer0.1% SDS1% Triton X-1002 mM EDTA pH8150 mM NaCl20 mM Tris-HCl pH8Final Wash Buffer0.1% SDS1% Triton X-1002 mM EDTA pH8500 mM NaCl20 mM Tris-HCl pH8Elution Buffer1% SDS100mM NaHCO3Proteinase KDissolve in H2O at 20 mg/ml, store at -20°C. 2.。