兽用疫苗常用免疫佐剂的概况和发展趋势_李茂

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Chinese Veterinary Public Health Association，CAA V
兽用疫苗常用免疫佐剂的概况和发展趋势
李茂1，刘天强1，肖丹1，史子学2
（1.通威股份有限公司动物保健研究所，成都 610041；2.中国农科院上海兽医研究所，上海
200241)
摘要：免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质。

佐剂种类很多，如铝盐佐剂、油乳佐剂、微生物佐剂、中草药类佐剂、细胞因子、化学合成类和其他佐剂等。

本文介绍了各种佐剂的研究应用概况，以期为开发研制高效、低毒和结构新颖的免疫佐剂提供参考。

关键词：免疫佐剂；免疫应答
THE PROGRESS AND DEVELOPMENT TREND OF THE COMMONLY USED IMMUNE ADJUVANT IN VETERINARY VACCINES
LI Mao1，LIU Tian-qiang1，XIAO Dan1，SHI Zi-xue2
（1.Animal Health Research Institute of Tongwei Co.,LTD,Chengdu 610041，China；2.Shanghai Veterinary
Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China）
Abstract: Immune adjuvant，also known as adjuvant or antigen adjuvant, immunogenicity generally alone,but when combine with antigenic material can enhance the antigen substance immunogenicity ,enhance immune response, or alter the immune response type substances. Many different types of adjuvant, such as aluminum adjuvant, oil emulsion adjuvant, Chinese herbal medicine,cytokines,chemical synthesis and other adjuvants. This article describes the research and application of a variety of adjuvants,in order to provide a reference for the development of efficient, low toxicity and structure of the novel adjuvants.
Key words: Immune adjuvant; Immune response
1 非油乳佐剂
1.1 铝盐佐剂铝盐佐剂是传统佐剂中的一类，包括氢氧化铝胶和磷酸铝等，一直广泛用于人用和兽用疫苗的制备。

主要诱导体液免疫应答，抗体以IgG1类为主，刺激产生Th2型反应[1]。

铝佐剂可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平，也比较安全，对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。

但仍存在缺点，皮下注射时常有肿胀或结块，抗原免疫原性弱时，不足以提高其免疫原性，特别是保护性免疫机制要求T细胞活性介导的免疫参加时,应使用其他佐剂。

1.2 微生物佐剂微生物佐剂主要有脂多糖、分枝杆菌等。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂蛋白，由多糖和脂质A组成，脂质A是LPS的活性分子，可引起动物特异性应答。

大量的试验结果证明LPS具有增强对细菌、病毒、真菌、寄生虫等感染的抵抗力，延长体液免疫的作用，可提高人和动物抗疟原虫感染的能力。

LPS可以单独使用，也可结合脂质体使用。

脂质A经去掉一个磷酸基，则产生单磷酸酰脂质A(MPL)，MPL 受体介导的活性抗原呈递细胞可促进单核因子的分泌，抑制Th2细胞，选择性地诱导Th1的增殖，分泌产生IL-2和INF-γ，并选择性产生IgG2抗体亚型，降低LPS的毒性[2]。

分枝杆菌在兽医中广泛地应用于疫苗, 如牛分枝杆菌卡介苗是早期应用成功的一种。

分枝杆菌经化学和物理方法处理，可获得具有佐剂活性的片段，包括MDP、MTP、蜡质D等，其中对MDP、MTP研究的较多。

MDP是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种免疫活性成分，可刺激免疫细胞如T细胞的增殖，调节及活化单核巨噬细胞，吸引吞噬细胞，进一步增强吞噬细胞和淋巴细胞活性，使其易捕获抗原,MDP单独使用也可激活机体的非特异防御机制。

MTP已用在疟疾疫苗中并取得了良好效果[3]。

1.3 中药草类佐剂
1.3.1 蜂胶蜂胶是一种天然的免疫增强剂和刺激剂，具有增进机体免疫功能和促进组织再生的作用。

据报道，应用蜂胶或配合抗原能增强免疫功能以及补体和吞噬细胞活力，增加白细胞的产生和抗体产量，并使特异性凝集素的产生大大增加[4]。

1.3.2 皂苷与免疫刺激复合物皂苷(QuiA)是一种表面活性剂，在低剂量时具有佐剂活性，用于多种兽用病毒、细菌和寄生虫疫苗。

它的主要成分QS21是水溶性的，并可用于乳剂或非乳剂型疫苗，可诱导鼠的Th1型反应，刺激IgG2a和IgG2b抗体的产生，并可诱导MHCI型
中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会101
反应[5]。

各种病毒膜蛋白抗原，掺入到皂苷及胆固醇中，形成一种免疫刺激复合物(ISCOM)。

ISCOM能显著增强T细胞增殖分化，诱导特异性抗体IgG2a、IgG2b及IgG3亚型的产生；提高MHCⅡ类分子的表达；刺激MHCI类限制性的CD+8T细胞抵抗内源性抗原；并能通过诱导C2干扰素的释放而起作用，还能克服母源抗体的封闭作用，并可用于通过粘膜途径递呈抗原[5]。

1.3.3 多糖、糖苷及复方中药从中草药植物中提取糖苷，与新城疫病毒及类脂混合，在一定条件下形成一种性能稳定的复合制剂，免疫增强作用明显。

从高等植物或某些大真菌中提取的多糖，比如苜蓿多糖可使脾淋巴指数和淋巴细胞数量显著提高，可诱导抗体产生水平提高，可部分颉抗环磷酰胺降低淋巴细胞的作用，并有缩短细胞周期的作用。

此外，一些复方中药也可作为佐剂，如紫术散、当归补血汤、四君子汤、玉屏风散、小柴胡汤等[6]，对免疫激活和提高免疫都有很大的作用。

总之，中药佐剂安全、有效、可靠、稳定，是一个很有发展前景的佐剂。

1.4 细胞因子细胞因子作为免疫佐剂的研究主要集中在白细胞介素(IL)、干扰素(INF)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及转移生长因子(TPG)。

最早用作佐剂的细胞因子是IL-1，可增强小鼠对牛血清白蛋白的二次抗体应答，但因其具有热原质活性而未被应用。

用羊IL-1β中和单克隆抗体的试验结果表明，IL-1β介导的佐剂作用直接与细胞因子的生物学活性有关，而不受重组蛋白制品混入的物质(如LPS等)影响，是抗多种疾病的疫苗佐剂。

用重组牛IL-2作为金黄色葡萄球菌菌苗佐剂，研究结果发现乳汁中假囊膜抗体效价明显升高[7]。

此外，其他白细胞介素同样具有佐剂效应。

还有INF-γ与抗原同时注射可激发Th细胞(辅助性T细胞)对抗体和迟发型变态反应应答，可增强IL-1的释放度以及抗原递呈细胞上MHCⅡ类分子的表达。

2 油乳佐剂
2.1 油乳佐剂作用原理油乳佐剂作为疫苗佐剂使用已经有几十年历史。

此类佐剂应用也最为普遍，在动物实验中大量使用，分为水包油型(O/W)、油包水型(W/O)、水油水型(W/O/W)，有些还包含其他免疫刺激性物质[8]。

其作用机理尚不完全清楚，大致上有如下解释：首先，乳状液在注射部位的贮库效应能延长抗原在体内的存留时间，缓慢释放抗原，从而持续刺激机体，提高抗原的免疫原性；第二，乳剂能够包裹抗原，保护其不被体液中的酶迅速分解，延长抗原刺激机体的时间；第三，乳剂会在注射部位引起细胞浸润，促使抗原呈递细胞（APC）如巨噬细胞、淋巴细胞等聚集和增殖从而提高免疫应答水平；此外，油乳佐剂还可以刺激各种细胞因子如IL-2、IL-6等的分泌，促进抗体产生[10]。

2.2 油乳佐剂的分类油乳佐剂包括矿物油佐剂、非矿物油佐剂。

作为矿物油佐剂最为人熟悉的可能是弗氏完全佐剂（FCA）和不完全佐剂（FIA），这两者均广泛应用于动物免疫。

FCA是在矿物油和乳化剂组成的W/O乳液中加入灭活的分支杆菌制成的，是很强效的佐剂，但毒性较大。

FCA中不加入分支杆菌时，就成为FIA。

FIA活性不如前者，但其毒性较小，其副作用只出现在注射部位。

但在对小鼠的研究中，发现其有致癌作用[8]。

除了FCA和FIA，基于矿物油的佐剂还有Specol佐剂、Montanide ISA50、ISA206等。

除了矿物油，其他油脂也可以制成油乳佐剂。

比较常用的有植物油（如花生油）、角鲨烯和角鲨烷等[9]。

2.3 矿物油佐剂与非矿物油佐剂的比较佐剂-65就是以花生油为油相，Arlacel A为乳化剂，并加入单硬脂酸铝作稳定剂的W/O佐剂。

Woodhour等进行的长期动物实验表明，除了注射部位的反应外，认为没有证据表明它会引发其他病变，也没有致突变性。

但和FA相比，佐剂-65的活性较差。

它们的特点是在体内能被代谢，因此副反应比矿物油轻。

比较受人们关注的是角鲨烷和角鲨烯[11]，两者制成的乳液均为有效的佐剂，可以提高体液和细胞免疫反应，若添加某些嵌段共聚物或者胞壁酰二肽等免疫调节剂可增强其活性，并且没有显著的副作用。

目前已经研制出一些具有良好的、明确的理化性质，无显著的系统或局部副作用的乳剂佐剂，如MF59、SAF和MontanideISA720等。

与矿物油佐剂相比，以角鲨烯和角鲨烷为油相的新型油乳剂既有良好的免疫效果，又没有严重的不良反应，已经成为当前研究的热点[12]。

但是，由于其原料价格较高，而且MF59等佐剂已获得专利，疫苗的成本会比传统矿物油佐剂疫苗高得多。

因此，新型佐剂在动物疫苗中的应用会受到一定限制。

关于矿物油佐剂作用机制的研究,最初的观点认为是同铝佐剂一样具有缓释功能。

Herber 和Freund均证明缓释功能并非油佐剂的最大优势。

Freund利用弗氏佐剂疫苗免疫兔子后30min-4h后移除注射部位，发现免疫应答虽有所降低，而1d或若干天之后移除注射部位则对
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免疫应答无太大影响[13]。

SeppicISA系列之一:ISA720在疟疾疫苗试验中能诱导小鼠产生特异性抗体应答、淋巴细胞增殖和CD8+T细胞应答，这种佐剂虽然会产生轻微局部疼痛，但其免疫耐受性极好，且抗体滴度能够维持两个月，效果优于铝佐剂。

MF-59TM(吐温80和司盘85制备的水包鲨烯乳剂)是一种O/W纳米乳佐剂(平均粒径<250nm)，为继铝佐剂之后唯一被批准的人佐剂，在意大利获准作为流感疫苗佐剂使用。

它对各种动物和各年龄段的人均可产生高于铝佐剂水平的抗体，用量少、安全毒性极低。

白油Span佐剂是用轻质矿物油（白油）作油相，用Span-80或Span-85及Tween-80作为乳化剂制成的油乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常用最有效的佐剂之一。

美国H.D.Stone等的研究证明[14]，既含油相乳化剂又含水相乳化剂的疫苗比仅含油相乳化剂的疫苗所引起的HI抗体滴度高2-4倍，在37℃条件更稳定，粘度也低。

Mosca等研究证实，MF-59TM可增加树突状细胞(dendritic cell,DC)淋巴细胞增殖，增强抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)的抗原递呈作用，刺激细胞因子的产生和APC向淋巴结的迁移，诱导产生强的IgG1和IgG2亚型免疫应答。

MF-59TM在单纯性疱疹病毒(Herpessimplex virus,HSV)、乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)、人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)疫苗的临床使用中都产生了良好的免疫耐受性[15]。

Boyce等研究表示，采用滴鼻方式免疫MF-59佐剂疫苗，该佐剂仅能刺激机体产生黏膜免疫应答，而不能诱导体液免疫应答，但它因为经注射途径给药，能够引起强的体液免疫应答而仍将具有广阔的应用前景。

AS03(吐温80、角鲨烯和维生素E乳化制得)同MF-59都是O/W乳剂，安全无毒且能引起较强的免疫应答，并且具有交叉保护的能力，和MF-59同样被欧盟批准在流感疫情紧急时候销售[16,17]。

3 展望
随着研究的深入，免疫佐剂的应用范围也从疫苗开始不断扩大，包括免疫治疗药物、肿瘤疫苗，增强机体对细菌、病毒、真菌、寄生虫的抵抗力和免疫应答。

随着基因工程和核酸技术的发展，DNA重组苗、多肽苗和亚单位苗已逐步被兽医临床应用，但这些疫苗免疫原性比较弱，需要同安全、有效的免疫佐剂结合加以改进。

没有一种佐剂适用于所有抗原、动物种类和实验条件，每种佐剂都有其优点和缺点。

佐剂是外源性物质，除了所需要的免疫刺激作用外，还能引起不良反应。

理想的免疫佐剂应当是以最小的免疫刺激可引起适当的免疫促进作用，且无不良反应。

相信将来会有更多的佐剂用于疫苗免疫接种，佐剂系统的有效应用会在人类和动物的疾病预防等领域发挥更大的作用。

由于油乳剂具有缓慢释放抗原等特点，是很有价值的传递系统。

未来对油乳佐剂的研究将着眼于在提高免疫效力和减少疫苗的毒副作用之间、改善佐剂性能和降低成本之间取得最佳平衡。

另外，对油乳剂的表征、稳定性、作用机理的研究还需要继续深入，这些研究将使油乳佐剂得到持续的发展。

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