细胞毒性讲义

d) 弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性 对照液，阳性对照液，100％ 和50％浓度的试验样品 浸提液。每组至少设8孔。 e) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱, 在7℃±2℃温度 下进行培养。培养间期可分为24h、48h、72h。 f) 每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二 氧化碳的二氧化碳培养, 在37℃±2℃温度下培养5小 时。 g) 弃பைடு நூலகம்孔内液体，每孔分别加入200μl DMSO，将培养 板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜色均匀。 h) 用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定，选用的波 长可为570nm和630nm。
噻唑蓝比色法
噻唑蓝（MTT）比色法是目前应用最广泛的一种检验细胞 活性的方法 原理：线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难 溶解的蓝色结晶Formazan
Formazan 含量
细胞活性
琥珀酸脱 氢酶活性
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠 成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。 如能证明试验的重现性和精确性，也可选用 其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从 认可的贮源获取。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。 使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应除去, 使 用前至少传代培养一次。
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1） 浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 浸提液试验（MTT）比色法 或MTT法： 哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降 解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜 （DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定 其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该 试验用于细胞毒性细定量评价。对该试验有 干扰的供试品不适于本试验。
细胞毒性
定义：由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤 事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时 需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
根据欧洲标准化组织CEN1992年30号文件的定义, 细胞毒性是指由产品、材料及其浸渍物所造成的细 胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制。
检测：主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用 以下几种方法：
试验步骤:MTT法
a) 培养细胞直至达到其对数生长期末细胞趋于融合， 用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成 1×104个/mL的细胞悬液。 b) 取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬浮液。轻 轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。 c) 置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱内, 在37℃±2℃ 温度下培养24小时。
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细胞存活率 Cell % 测试孔 DMSO T/D*100 0.634 0.5553 114.18 0 10 20 40 60 80 100
0.55525 0.5553 100.00
0.3915 0.5553 70.51
0.30175 0.5553 54.34
0.15125 0.5553 27.24

试验材料：仪器
超净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光 学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液 氮瓶、抽滤瓶、电热恒温水浴锅、96孔培 养板、可调式微量加样器、酶标仪纯水机、 液氮罐、天平、离心机等。
试验材料：耗材
培养瓶、培养板、吸管、冻存管、离心管、 滤器等。
与供试品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌 器内 121℃灭菌 20分钟。
i) 结果计算：
(1) 细胞存活率%=加药细胞的OD值/对照细胞的OD值* 100 (2) LOEC (lowest observed effect concentration) IC50 (concentration leading to a 50% decrease of cell growth) ：T/C=50% 约 20 uM ，即21.65 uM
试验原则
体外细胞试验方法较多，且各有其特点， 各试验方法之间很难达到完全一致。因此在选 择试验方法时，须根据“最接近应用状况”的 原则，尽可能合理地选择供试品与细胞的接触 方式和检测生物学终点评价方法。
如果圣诞老人给我一个机会，我会对你说：圣诞快乐！ 一定要在快乐上加上一个期限，我希望是：一万年!
MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行 转化，然后通过酶标仪进行检测 LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等
细胞形态 学观察
细胞毒性检测
细胞生长 状态观察
代谢活性
细胞活性检测 指标
膜电位
细胞膜对核酸染料的通透性
细胞毒性试验
2008-09-22
目的和意义
（一）目的：通过体外细胞培养技术，可检测供试 品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、溶 解、死亡或其它毒性反应。
（二）意义：可在短期内较经济、简便地筛选出批 量供试品的细胞毒性，它为体内法（动物试验） 的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械和 生物材料的研制和应用提供了重要保证。
0.0865 0.5553 15.58
0.04325 0.5553 7.79
0.0365 0.5553 6.57
经验与技巧
• 细胞接板
• 待测物质处理细胞 • 弃去反应液 • DMSO溶解formazan
哪些产品需要进行 细胞毒性试验？
与人体接触或植入体内的医疗器械都需要 进行细胞毒性试验。 接触部位： 1）表面：皮肤、粘膜、损伤表面 2）外部接入：血路间接、组织/骨/牙、 循环血液 3）体内植入：组织/骨、血液
试验材料：试剂
培养基（MEM、DMEM、RPMI1640等）、 血清（小牛血清、胎牛血清、马血清等）、 消化液、抗生素液、NaHCO3 溶液、二甲基亚 砜、平衡盐溶液。
含血清或不含血清培养基应符合选定细胞系的 生长要求。 注: 培养基中允许含有对试验无不利影响的抗 生素。
试验材料：供试液与对照
供试液：应按产品标准规定制备样品浸提液。 阴性对照：选用经确认过的不产生细胞毒性 反应的材料，例如高密度聚乙烯。 阳性对照：选用经确认过的可重现细胞毒性 反应的材料，例如含有有机锡添加剂的聚氯乙烯。