小鼠基因组提取与基因型鉴定

小鼠基因组提取与基因型鉴定

一．小鼠基因组提取

1．试剂与纯化柱

2.方法

2.1 剪0.4- 0.6 CM鼠尾，切成小块，装进1.5mlEP管中，加300ul 裂解

液.(自配的裂解液，配方见下表)

2.2 加入10ul蛋白酶K，充分混匀，56℃过夜(约16个小时),或加入30ul蛋白

酶K，充分混匀，56℃2h。

2.3 尾巴完全裂解后，取出，充分混匀，直至混液成均匀且无结块，向管内

加入50ul Buffer AL，充分混匀。然后加入200ul无水乙醇，充分混匀

（用手上下颠倒混匀，动作不宜过猛，防止DNA断裂）。

2.4 将上述混合液加入到装有2ml收集管的柱子中，12000rpm离心1min，倒

掉废液，将柱子放回收集管。

2.5 向柱子中加入250ul Buffer AW1，静置2-3min，12000rpm离心1min，倒

掉废液，将柱子放回收集管。

2.6 向柱子中加入250ul Buffer AW2，静置2-3min，12000rpm离心1min，倒

掉废液，空离2min。注意：此步拿柱子时不要碰到收集管中的液体。2.7 将柱子放到一个干净的1.5ml离心管中，开口放15min左右，（残留的液

体蒸发干，残留的乙醇对PCR有影响））（有条件的可放在安全柜中通风吹干10-15min）

2.8 向柱子中心慢慢滴加200ul无菌去离子水。室温静置3min，12000rpm离

心2min，为增加基因组DNA的回收率，可将离心得到的溶液再加入吸

附柱中，室温放置2min，12000prm离心2min。

小鼠基因组裂解液的配制（1000ml为例）

二．小鼠基因型鉴定

1. 基因型鉴定方法：采用PCR检测方法，以确定小鼠为纯合子/杂合子/野生型1.1引物

引物对及扩增片段大小

引物序列 （5’→3’）

1.2 引物稀释方法

1） 100µM 储存液：先把合成好的引物粉末置于离心机中于12000转离心3-5min,之后取出并小心打开盖子，加入一定量微摩的水吹打混匀，然后瞬时离心（注加入管内的去离子水为管壁上总nmole 数乘以10）

2）10µM 的使用液：将储存液稀释10倍，上下引物稀释到同一个管中，引物不要反复冻融，分装保存于-20℃。 1.3 PCR 反应体系：总体系15ul

引物1 引物2/3

1.3 反应条件

95℃5min ；95℃30s ，63℃30s ，72℃3min 共30个循环；72℃10min ；12℃∞。

1.4 琼脂糖凝胶电泳

PCR 产物于1%琼脂糖凝胶电泳,上样量为8ul,电压为100-150V 。 1.5 数据处理与结果分析

PCR MIX 8µl 引物2/3 1.2µl 模板 0.6µl 去离子水 5.2µl

PCR MIX 8µl 引物1 0.6µl 模板 0.3ul 去离子水 6.1 µl

用Adobe Photoshop 7.0软件把样品标号标记在琼脂糖凝胶电泳图片上，样品PCR产物条带与纯合子、杂合子、野生型PCR产物条带做比照，以确定样品为纯合子、杂合子或野生型。本试验只取纯合子小鼠颌下腺用于后续蛋白提取。