Miseq标准化操作指南中文翻译版

DNA缓冲液Tagment DNA Buffer (TD)
DNA酶1 Tagment DNA Enzyme (TDE1)
目的DNA转移到冰上。

缓冲液颠倒混匀、酶不适合旋涡，易损坏酶片段。

把样本纯化磁珠从2-8度冰箱取出，至温度升到室温。

确保终止连接缓冲液（ST）没有沉淀，如有沉淀要旋涡，直到所有颗粒物悬浮起来。

多试剂处理，使用排枪，分装洗脱缓冲液，目的DNA缓冲液，和DNA酶，分装到八连排管中，保证每个孔的体积一致。

把样品纯化磁珠倾倒至多通道反应管中。

将深孔板插入到加热体模块中，预加热垂直混匀仪至58度。

取一个深孔板，用记号笔签字。

操作
确保反应试剂分装时，为了最好的描述试剂盒信息，反应液分装不需要再冰上操作。

1. 按照以下步骤标准化
a)检测目的DNA样本的质量，使用紫外分光光度计或者Qubit，
b)每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到10ng/μL。

c)再次检测5ng/μL的目的DNA样本质量，使用紫外分光光度计或者Qubit。

d)在此基础上，每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到5ng/μL，取10μL
备用。

配置方法：原DNA浓度为18 ng/μL，配置成体积为20 μL，浓度5ng/μL 的DNA，取原液的体积是20*5/18，取Tris-HCl体积为20-（20*5/18）。

2. 取一0.2mL的干净离心管，加入以下成分：
10μL（5ng/μL）gDNA + 25μL Tagment DNA Buffer + 15μL Tagment DNA Enzyme
涡旋振荡混匀，1800转1min，避免有气泡，58℃，10min。

注意：用普通PCR仪，先让机器预热到58℃，再放样品。

大样本可用深孔板操作。

在垂直混匀仪上操作。

3. 结束后，向管中加15μL Stop Tagment Buffer，涡旋振荡，短暂离心。

室温放
置反应4min。

【此时体系共65μL】
（三）纯化：因为转座酶与DNA末端紧密结合，会干扰下游反应过程
准备
样品重悬洗脱液RSB，样品纯化磁珠SPB，80%乙醇取出，降温至室温。

1.配制80%的乙醇，（8mL无水乙醇+2mL纯水）共10mL，备用。

2.纯化试剂提前取出，室温平衡放30min，充分混匀（平时4℃保存）。

3.取一0.5mL的干净离心管，分装SPB磁珠（红色盖子，棕色液体），每管65μL。

把上述体系每管样品(65μL)转移到分装好的磁珠液（65μL）中，充分振荡混匀，1800转离心1分钟，室温放置反应8min。

【此时体系共130μL】
4.把样品管放到磁力架上2min，直到液体澄清。

5.把管中的上清液吸弃（使用200微升的枪和排枪），尽量不要避开磁珠，不
要吸走磁珠。

[再把上清打回管中，把磁珠冲洗一次——此步骤可选做]。

目的是让磁珠充分结合buffer，和双链DNA结合。

6.沿管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80%乙醇，尽量不要碰到磁珠，要让乙醇
完全浸没磁珠，反应30s。

7.30s后吸弃上清，注意不要吸走磁珠（去乙醇）。

8.重复上述两步骤，二次清洗，操作同上，短暂离心，把残留乙醇离到管底，
使用20μL吸弃底部乙醇。

注意：离心时把有磁珠的一面朝外，不要把磁珠离下来。

9.把管放回磁力架上，室温晾3-5分钟。

10.向管中沿壁加22.5μL的Resuspension Buffer（重悬缓冲液）（紫色盖子50mL
管），涡旋振荡充分混匀，室温反应2min。

11.短暂离心，把离心管放到磁力架上2min，直到液体变澄清。

12.取一0.2mL的干净离心管，转移上清20μL，尽量避免碰到磁珠。

【此时每管
体系20μL】
13.用Agilent2100生物分析仪，检测管中剩余2.5μL样品，分析纯化产物的质
量——此步骤可选做。

（四）加样/加标签
准备：
Mix反应液从-15 to-25℃转移到冰上。

2+20μL Mix酶）
（提前预热仪器）
设置程序：72℃3min
98℃30s
10℃∞
5.把磁力架上管中剩余2.5μL液体，用ddH2O稀释至1ng/μL，用Agilent2100
生物分析仪检测片段质量。

（五）第一次洗脱，洗脱非特异性结合产物
准备：
Resuspension Buffer (RSB) 重悬洗脱液
Sample Purification Beads (SPB) 样品纯化磁珠
Freshly prepared 80% ethanol(EtOH) 新鲜的80%乙醇
确保以上三个试剂都降到室温。

多样本操作，准备排枪，把上述三个试剂都分装到储液器中，利于排枪操作。

标记一个新的96孔板
标记一个新的96孔硬座板
操作：
1.取12个干净的1.5mL离心管，管中分别加90μL磁珠（Sample Purification
Beads）。

2.取出PCR仪上的离心管，短暂离心，把每个管中的液体全部加到90μL磁珠
中，振荡混匀，室温静置反应10min。

【此时体系共有140μL】
3.把离心管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

4.吸弃管中上清，避免吸到磁珠。

5.每管加190μL新鲜配制的80%乙醇，静置30s，吸弃上清（第一遍）。

6.步骤同上（第二遍）。

7.用小量程的移液枪把管底的乙醇吸净弃去。

（注：此时管还在磁力架上）
8.把管从磁力架上取下，向其中加入27μL的Resuspension Buffer。

充分振荡混
匀，室温放置反应2min，期间可用手指弹开磁珠，短暂离心。

9.把管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

10.取12个1.5mL的干净离心管，转移25μL上述液体到其中，充分振荡混匀，
短暂离心。

11.取Qubit专用Ep管，每管加190μL染液+1μL上述样品，充分振荡混匀，放
置反应2min。

注意：避光。

12.用Qubit2.0检测每管浓度，按照40μL样品中500ng的标准稀释，即12.5ng/μL
（纯化后浓度按要求稀释，500ng是指样品和探针结合的饱和度）。

13.已测此时浓度A`，B`，C`………
250
= a`，b`，c`……(500/2=250,)
A`，B`，C`…
a`+b`+c`=X` 220- X`=Y`
14.取一1.5mL的干净离心管，把上述X`的体积全部转移到其中，加RSB（洗
脱液）Y`到上述体系中——DNA Library Sample。

15.提前取出Streptavidin Mggnetic 磁珠（室温平衡30min），捕获探针oligos
（CSO），杂交Buffer（EHB），轻柔振荡，短暂离心。

16.取一0.2mL的干净离心管，加
上述体系液体40μL+50μLEHB+10μLCSO，充分振荡混匀，短暂离心。

【此时体系共100μL】
17.上PCR仪，设置程序：95℃10min
94℃，每1×-2℃1min 18×
58℃ 1.5-24h
（六）第一次捕获杂交探针
1.取出PCR仪中的离心管，把管中样品全部转移到一个干净的1.5mL离心管
中。

加入250μL的Streptavidin Mggnetic 磁珠，充分振荡混匀，短暂离心，室温反应25min。

【此时体系共250μL】
2.充分振荡混匀，把离心管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

3.小心吸弃上清，避免吸到磁珠。

4.向管中加如200μL的Wash Solution洗脱液（EWS，白色盖子，室温），充分
振荡混匀。

5.放入Thermo Mixer上，50℃，30min。

（可不振荡）
6.结束后，立即把管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清，吸弃上清。

注
意：把磁力架放到Thermo Mixer旁边，一旦结束，立即转移。

7.重复上述洗脱步骤，50℃，30min，吸弃上清，最后用小量程的移液枪把管
底残留液体吸净。

[上述目的是使磁珠与双链DNA充分结合]
8.取一1.5mL的干净离心管，加入以下成分：
EEB 28.5μL+NaOH 1.5μL，共30μL。

9.充分振荡混匀，短暂离心，吸取23μL上述配好的混合液，加入到磁珠管中，
涡旋振荡混匀，室温反应2min。

[此目的是用碱性NaOH把碱基和Oligo洗脱开来=解链]
10.把管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

11.取一0.2mL的干净离心管，向其中转移上述体系中的液体21μL，再加4μL
的Elute Target Buffer2（ETB），充分振荡混匀。

【此时体系共25μL】
（七）杂交
1.向上述体系中加入15μL的Resuspension Buffer（紫色盖子）。

【此时体系共
40μL】
2.向上述体系中加入50μL的Hybridization Buffer（杂交buffer）,用前充分旋涡，
促沉淀融解。

3.再向上述体系中加入10μLCSO探针，充分振荡混匀。

【此时体系共100μL】
4.上PCR仪，设置程序：
95℃10min
94℃，每1×-2℃1min 17×
58℃14.5h以上（过夜），
注意：第一天做到这一步
（八）二次捕获
[此目的是用磁珠捕获和杂交探针结合的目标区域，洗去非特异性结合产物，为后续测序做准备]
1.次日，提前取出Streptavidin Mignetic Beads(SMB)恢复到室温，用前充分震
荡混匀直到融解。

取出PCR仪中的离心管，取一1.5mL的干净离心管，向其中转移100μL的液体。

2.向管中加入250μL SMB磁珠，充分振荡混匀，室温放置反应25min。

3.把管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

吸弃上清，避免碰到磁珠。

4.把管从磁力架上取下，加200μL的Enrichment Wash Solution（EWS，白色盖
子），充分振荡混匀。

5.短暂离心，用手指轻弹管底，放入Thermo Mixer上，50℃，30min。

6.结束后，立即把管放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清，吸弃上清。

注意：把磁力架放到Thermo Mixer旁边，一旦结束，立即转移。

7.重复上述洗脱步骤，50℃，30min，吸弃上清，最后用小量程的移液枪把管
底残留液体吸净。

8.取一1.5mL的干净离心管，加入：
NaOH溶液（15μL）+ Enrichment Elution Buffer1（28.5μL）=30μL，充分振荡混匀。

9.转移上述液体23μL到磁珠管中，充分涡旋振荡，短暂离心，室温放置反应
2min。

10.把管放到磁力架上，静置2min ，直到液体澄清。

11.取一干净的1.5mL离心管，向其中转移上述澄清液体21μL，注意不要吸到
磁珠。

12.再向管中加4μL的Elute Target Buffer2，充分振荡混匀。

【此时体系共25μL】（九）捕获纯化产物
1.取出磁珠（红色盖子），充分涡旋混匀，取45μL加入上述体系中，充分振荡
混匀，室温放置反应10min。

【此时体系共70μL】
2.把管子放到磁力架上，静置2min，直到液体澄清。

3.吸弃上清，尽量不要吸到磁珠。

4.向管中加190μL的80%乙醇，放置30s，吸弃上清。

5.再洗一次，步骤同上，可短暂离心（注意有磁珠的一面朝外），用小量程的
移液枪把残留乙醇也吸弃，室温凉2min。

6.把离心管重新放回磁力架，向管中加2
7.5μL的Resuspension Buffer（紫色盖
子），用手指弹开，室温放置反应2min，直到液体澄清。

7.取一0.2mL的干净离心管，向其中加入25 μL的上述澄清液体。

（十）二次PCR扩增
1.再向管中加入5μLPCR引物（PCR Rrimer Cocktail）和20μL酶NEN（Nextera
Enrichment Amplification Mix），吹打充分混匀。

2. 上PCR 仪，设置程序：
98℃ 30s
98℃ 10s
60℃ 30s
12×
72℃ 30s
72℃ 5min ，10℃保存
【此时体系共50μL 】
期间，用Qubit2.0检测剩余2.5 Qubit2.0样品浓度。

1. 已有2nM 的NaOH ，用ddH 2O 稀释至0.1nM ，充分振荡混匀，短暂离心，重
复两次，记为“管1”。

2. 取一1.5mL 的干净离心管，加入8μL 的冰浴杂交Buffer （HT1），记为“管2”。

3. 向管2中加入2μL 的PhiX 。

4. 取10μL 管1中的NaOH 加入到管2中，此时管2中共有20μL 体系。

5. 取一干净的0.5mL 的离心管，记为“管3”，向其中加入10μL 样品（0.254
ng/μL）。

6.再向管3中加入10μL管1中的NaOH，此时管3中共有20μL体系。

7.管2、管3充分振荡混匀，短暂离心，重复两次，室温放置反应5min。

8.将管2、管3立即放入冰盒中孵育，再分别向两管中各加980μL的HT1，定
容到1000μL。

此时样本浓度有15.78pM，PhiX浓度有20pM。

（相当于样本终浓度被稀释100倍，终浓度变成1.578×103 pmol/L/100稀释倍数=15.78pM）
管2配方：10μL NaOH+8μL HT1+2μL Phix1 +980 HT1
μL 9.
10.。