Miseq标准化操作指南中文翻译版
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DNA缓冲液Tagment DNA Buffer (TD)
DNA酶1 Tagment DNA Enzyme (TDE1)
目的DNA转移到冰上。缓冲液颠倒混匀、酶不适合旋涡,易损坏酶片段。 把样本纯化磁珠从2-8度冰箱取出,至温度升到室温。
确保终止连接缓冲液(ST)没有沉淀,如有沉淀要旋涡,直到所有颗粒物悬浮起来。
多试剂处理,使用排枪,分装洗脱缓冲液,目的DNA缓冲液,和DNA酶,分装到八连排管中,保证每个孔的体积一致。把样品纯化磁珠倾倒至多通道反应管中。
将深孔板插入到加热体模块中,预加热垂直混匀仪至58度。
取一个深孔板,用记号笔签字。
操作
确保反应试剂分装时,为了最好的描述试剂盒信息,反应液分装不需要再冰上操作。
1. 按照以下步骤标准化
a)检测目的DNA样本的质量,使用紫外分光光度计或者Qubit,
b)每个样品用10mM的Tris-HCl(pH8.5)稀释到10ng/μL。。
c)再次检测5ng/μL的目的DNA样本质量,使用紫外分光光度计或者Qubit。
d)在此基础上,每个样品用10mM的Tris-HCl(pH8.5)稀释到5ng/μL,取10μL
备用。配置方法:原DNA浓度为18 ng/μL,配置成体积为20 μL,浓度5ng/μL 的DNA,取原液的体积是20*5/18,取Tris-HCl体积为20-(20*5/18)。
2. 取一0.2mL的干净离心管,加入以下成分:
10μL(5ng/μL)gDNA + 25μL Tagment DNA Buffer + 15μL Tagment DNA Enzyme
涡旋振荡混匀,1800转1min,避免有气泡,58℃,10min。
注意:用普通PCR仪,先让机器预热到58℃,再放样品。
大样本可用深孔板操作。在垂直混匀仪上操作。
3. 结束后,向管中加15μL Stop Tagment Buffer,涡旋振荡,短暂离心。室温放
置反应4min。【此时体系共65μL】
(三)纯化:因为转座酶与DNA末端紧密结合,会干扰下游反应过程
准备
样品重悬洗脱液RSB,样品纯化磁珠SPB,80%乙醇取出,降温至室温。
1.配制80%的乙醇,(8mL无水乙醇+2mL纯水)共10mL,备用。
2.纯化试剂提前取出,室温平衡放30min,充分混匀(平时4℃保存)。
3.取一0.5mL的干净离心管,分装SPB磁珠(红色盖子,棕色液体),每管65μL。
把上述体系每管样品(65μL)转移到分装好的磁珠液(65μL)中,充分振荡混匀,1800转离心1分钟,室温放置反应8min。【此时体系共130μL】
4.把样品管放到磁力架上2min,直到液体澄清。
5.把管中的上清液吸弃(使用200微升的枪和排枪),尽量不要避开磁珠,不
要吸走磁珠。[再把上清打回管中,把磁珠冲洗一次——此步骤可选做]。目的是让磁珠充分结合buffer,和双链DNA结合。
6.沿管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80%乙醇,尽量不要碰到磁珠,要让乙醇
完全浸没磁珠,反应30s。
7.30s后吸弃上清,注意不要吸走磁珠(去乙醇)。
8.重复上述两步骤,二次清洗,操作同上,短暂离心,把残留乙醇离到管底,
使用20μL吸弃底部乙醇。
注意:离心时把有磁珠的一面朝外,不要把磁珠离下来。
9.把管放回磁力架上,室温晾3-5分钟。
10.向管中沿壁加22.5μL的Resuspension Buffer(重悬缓冲液)(紫色盖子50mL
管),涡旋振荡充分混匀,室温反应2min。
11.短暂离心,把离心管放到磁力架上2min,直到液体变澄清。
12.取一0.2mL的干净离心管,转移上清20μL,尽量避免碰到磁珠。【此时每管
体系20μL】
13.用Agilent2100生物分析仪,检测管中剩余2.5μL样品,分析纯化产物的质
量——此步骤可选做。
(四)加样/加标签
准备:
Mix反应液从-15 to-25℃转移到冰上。
2+20μL Mix酶)
(提前预热仪器)
设置程序:72℃3min
98℃30s
10℃∞
5.把磁力架上管中剩余2.5μL液体,用ddH2O稀释至1ng/μL,用Agilent2100
生物分析仪检测片段质量。
(五)第一次洗脱,洗脱非特异性结合产物
准备:
Resuspension Buffer (RSB) 重悬洗脱液
Sample Purification Beads (SPB) 样品纯化磁珠
Freshly prepared 80% ethanol(EtOH) 新鲜的80%乙醇
确保以上三个试剂都降到室温。
多样本操作,准备排枪,把上述三个试剂都分装到储液器中,利于排枪操作。 标记一个新的96孔板
标记一个新的96孔硬座板
操作:
1.取12个干净的1.5mL离心管,管中分别加90μL磁珠(Sample Purification
Beads)。
2.取出PCR仪上的离心管,短暂离心,把每个管中的液体全部加到90μL磁珠
中,振荡混匀,室温静置反应10min。【此时体系共有140μL】
3.把离心管放到磁力架上,静置2min,直到液体澄清。
4.吸弃管中上清,避免吸到磁珠。
5.每管加190μL新鲜配制的80%乙醇,静置30s,吸弃上清(第一遍)。
6.步骤同上(第二遍)。
7.用小量程的移液枪把管底的乙醇吸净弃去。(注:此时管还在磁力架上)
8.把管从磁力架上取下,向其中加入27μL的Resuspension Buffer。充分振荡混
匀,室温放置反应2min,期间可用手指弹开磁珠,短暂离心。
9.把管放到磁力架上,静置2min,直到液体澄清。
10.取12个1.5mL的干净离心管,转移25μL上述液体到其中,充分振荡混匀,
短暂离心。
11.取Qubit专用Ep管,每管加190μL染液+1μL上述样品,充分振荡混匀,放
置反应2min。注意:避光。
12.用Qubit2.0检测每管浓度,按照40μL样品中500ng的标准稀释,即12.5ng/μL
(纯化后浓度按要求稀释,500ng是指样品和探针结合的饱和度)。
13.已测此时浓度A`,B`,C`………
250
= a`,b`,c`……(500/2=250,)
A`,B`,C`…
a`+b`+c`=X` 220- X`=Y`
14.取一1.5mL的干净离心管,把上述X`的体积全部转移到其中,加RSB(洗
脱液)Y`到上述体系中——DNA Library Sample。
15.提前取出Streptavidin Mggnetic 磁珠(室温平衡30min),捕获探针oligos
(CSO),杂交Buffer(EHB),轻柔振荡,短暂离心。