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1.(原始的)色谱图为什么要经过数字化才能成为色谱指纹图谱？色谱指纹图谱数字化包括哪些内容？

一、基本概念

1、指纹图谱(Fingerprint)

指纹图谱是指某种或某产地样品中所共有的、具有特异性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。其特点在于通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地。通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品的相对稳定。

2、数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint)

数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint)又称相对保留值指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进行研究。

二、指纹图谱的发展、属性和作用

指纹图谱的产生与发展[1]，指纹图谱技术应用于植物药质盆控制可以追溯到上世纪年代初，随着色谱技术尤其是薄层技术的发展，人们大量采用薄层色谱的方法将植物药中化学成分展开于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上斑点的位值、斑点大小、斑点颜色、斑点数目的多少来进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法己具备了指纹图谱特征，并被广泛应用。80年代及90年代，由于薄层扫描仪的出现使得薄层鉴别方法得到进一步发展，日本和我国部分学者用当时的薄层扫描仪得到复方成药扫描图谱作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。现代新型的薄层扫配备有自动点样系统、成像系统、数据处理系统，可将薄层板色谱结果转变成类于液相的色谱图，薄层扫描色谱图与薄层色谱结果结合，相得益彰，使得薄层扫描术成为指纹图谱研究的主要方法之一。与此同时，高效液相技术得到了长足发展，随着植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的不断阐明，人们更多应用高效液相法行定性、定量分析。西方国家如德国、美国、加拿大等普遍采用高效液相色谱法对物药中己知及未知组分进行控

制，并形成相应的规范。新近几年国内有关学术期刊刊登了一些应用高效液相色谱法研究指纹图谱的论文。

何谓中药指纹图谱，谢培山教授将其定义为它是一种综合的，可量化的鉴别手段，现阶段，通过色谱指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优略、考察稳定性和致性，是一种复合中药特色的质量控制模式之一[2]。整体性和和模糊性是它的基属性。中药新药等的质量控制水平，以中药注射剂为重点，逐步扩大指纹图谱等多方法在中药质量控制中的应用.国家药监局要求中药注射剂在固定中药材品种、产和采收期的前提下，制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。现在不仅国内，而且国际都取得了共识，即中药不是单一组分在起作用，而是药物的整体起作用。对于色谱纹图谱中的各色谱峰，并不要求对每个组分的化学结构都清楚，也不需要对呈现在谱中的每个组分都清楚地定量，只需不同批号的同一种药品的指纹图谱保持基本一。即指纹图谱分析强调准确的辨认，而不是精密的计算，比较图谱强调的是相似，不是相同。中药指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况，可实现对中的多组分和多指标分析，对鉴别药材的真伪优劣及其稳定性均具有非常重要的参考值。中药指纹图谱还可以解决标准品缺乏的难题。即使在没有标准品的情况下，仍可选择以道地药材为标准对各中药样品进行鉴别和进行质量控制[63]。

三、指纹图谱的应用概况

近几年，中药指纹图谱的研究逐渐深入，设计的方法种类繁多，包括:

(l)、色谱法：传统的薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法和高效毛细管电泳法等；

(2)、光谱法：紫光谱法和红外光谱法等；

(3)、牌谱法：质谱法和核磁共振法等；

(4)、其他方法：如x射线射法，分子生物学方法等.其中色谱学方法是主流方法，尤其是TLC、HPLC和GC已经成为大家所公认的三种常规的分析手段.

四、色谱图经过数字化才能成为色谱指纹图谱的原因

数字化色谱指纹图谱(numerical chromatographic fingerprint)又称相对保留值指纹图谱，其原理是在所有参与比较鉴定样品的色谱图中确定一个在各鉴定样品中都有的色谱峰作为参比标准，然后求取所有色谱峰各自的相对保留值。将

色谱峰保留值转化为漂移较少、相对稳定的相对保留值，以此作为色谱峰的定位依据，加上各自的峰面积等参数，构成色谱指纹图谱。然后以这些由色谱图转换成相对保留值的数字化色谱指纹图谱作为标准，对那些参与比较的样品进行研究。

如果以样品的色谱图外形直接作比较，将存在许多实验过程中的系统误差和鉴定者的主观误差，例如流速的波动、进样量的差异、固定相的流失、校填充情况的细微变化、流动相的微小改变等操作引起的误差。当用每个色谱峰相对保留值及其相对应的面积归一化值作比较时，减少了保留值的漂移的影响，保证了色谱峰的正确定位，增强了鉴定的客观性、科学性和公正性。通过使用这些量化指标，将使色谱指纹图谱技术在中药质控和质标中发挥更大的作用。

五、色谱指纹图谱数字化的内容

1、相对保留值α的计算

在实验色谱条件下，色谱峰较多且相当密集，难以插入一个合适的参照物。选择一个出峰时间较居中、各样品中均存在的组分作内参照峰(可采用叠加法等方法予以标定)求出样品中所有峰的相对保留值α。

α= tRi/tRs

tRi ——各组分的出峰时间,

tRs ——内参照峰的出峰时间

2、α值窗口的设定

由于保留时间受各种实验因素的影响，每一次实验数据不可能完全一致，故对每个峰值的α值设定窗口如为1％或2％等，即通过大量的实验数据计算每个峰值的α值，取可信限在±l ％或±2％的范围内。

3、指纹图谱的建立

按样品各色谱峰α值的大小次序排序，在每个α项下标出该组分的相对面积值(RA)或归一化面积值(Ar)即组成了样品的HPLC —FPS 。

归一化面积值(Ar)＝s

i A A Ai ——某样品中某个色谱峰的峰面积，

As ——某样品中参照峰的峰面积

相对面积值(RA)＝ A A i

×100%