N-马来酰化壳聚糖的合成和性能

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化工进展
年第 卷 2007 26
1 实验部分
1.1 试验仪器与试剂
壳聚糖，浙江玉环海洋生物化学有限公司，脱
乙酰度 95.4％；透明质酸，美国 Sigma 公司，其余
试剂均为分析纯。大肠杆菌(Esaherichiacoli)、金黄
色葡萄球菌(Staphylococcusaurous)，由本校生环学院
680
75.6
M-6
2
0.5 0.36
587
67.5
M-7
2
0.75 0.54
670
75.7
M-8
2
1.25 0.70
750
81.5
M-9
2
1.5 0.76
776
83.0
M-10
2
1.75 0.81
805
83.8
M-11
2
2.0 0.83
815
84.3
M-12
2
2.5 0.83
800
83.1
M-13
1.7 抑菌性能测定[9] 无菌条件下挑取活化好的菌种接至无菌水中，
使菌液浓度达到 l08 cfu/mL 左右。将菌悬液涂布于 琼脂平板面，利用牛津杯法测定不同样品的水溶液 (浓度为 0.5％)的抑菌圈大小。
2 结果与讨论
2.1 不同取代度 N-MACH 的制备 温度、N–反马应来时酰间化、壳投聚料糖比衍（生马物来取酸代酐度物大质小的与量反与壳应 聚糖氨基物质的量之比）和吡啶添加量有直接关系。 研究表明，在乙酸/乙醇/吡啶体系中，在相同反应 并料温比度对（，其2可部0得分℃到理）一化和系性吡列质啶不进添同行加取研量代究下度（，的表改变2N）-反M。应AC时H间(表、投1)
2007 年第 26 卷第 3 期
化工进展
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS
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N-马来酰化壳聚糖的合成和性能
应国清，杨 好，李东华，杨铁军
（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 ） 310014
摘 要：通过酰化反应，制备一系列取代度不同的 N-马来酰化壳聚糖。测定了产物的取代度、特性黏度、相对分 子质量、吸湿保湿性，并用 、IR NMR 进行结构表征。研究发现高取代度高相对分子质量高黏度产物（M-11）的 吸湿保湿性、抑菌性均优于透明质酸，有望替代昂贵的透明质酸，开辟壳聚糖新的应用范围。 关键词：壳聚糖；吸湿性；黏度；透明质酸 中图分类号：O 636.1 文献标识码：A 文章编号： – （ ） – – 1000 6613 2007 03 0405 04
发酵实验室提供，经复壮(37 ℃，24 h) 3 次活化。核
磁共振仪，英国牛津 Varian Unity 400 MHz 型；红外
光谱仪，美国 型；冷冻干 Thermo Nicolet Avatar 370
燥器，美国 Labconco Freezone 6 型；HPLC，日本岛
津 系列，包括 控制器， LC-10AS
透明质酸（hyaluronic acid，简称 HA）是重要 的功能性生物材料。HA 除具有优异的生物相容性 和无免疫原性外，主要特点是其溶液具有高黏弹性， HA 在化工和医药中得到广泛应用主要依赖于它的 黏弹特性和保湿性。但是目前可供利用的 HA 数量 很少，HA 的市场价格很高[3]。
N-马来酰化壳聚糖（N-MACH）是一种含有羧 基的酰化壳聚糖，具有诸多优异的生物性能，其保 湿性能尤为突出，还可作为分子标记聚合物应用于
称取0.1000 g N-马来酰化壳聚糖溶于0.1 mol/L的
盐酸溶液中，用 0.0500 mol/L 氢氧化钠溶液滴定，作
盐酸体积数与 pH 值的关系图，计算产物取代度 。 DS
1.4 特性黏度测定
样品溶于 0.1 mol/L 乙酸+0.1 mol/L 氯化钠溶液
中，在 25 ℃下用乌氏黏度计测定。利用五点法计
研究表明，与透明质酸相比，在 RH 为 42％时， N-MACH 具有更好的吸湿保湿效果。而取代度为 0.83 的样品 M-11，相对分子质量和黏度较大，保湿 性尤为显著。因此，此样品有望代替透明质酸成为 新型保湿剂、润滑剂，应用于日用化工、临床医疗、 生化制药等领域。
MACH 在 3 005 cm－1 的吸收归属于双键中 — νC H 的伸缩振动，1 716 cm－1 的吸收对应为羰基 νC=O 伸缩振动强峰[6]。还有 1 635 cm－1 峰增强，是 νC=C 伸缩振动峰与酰胺Ⅰ谱带振动叠加的结果[6]。841 cm－1 处为双键中 δCH 面外弯曲振动峰。这些谱带 都指示了产物 N-MACH 的结构。
第3期
杨好等：N–马来酰化壳聚糖的合成与性能
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取反应时间为 2 h，当投料比小于 2.0 时，产物 取代度投料比明显增大。当投料比大于 2.0 时，取 代度增幅明显减小。同时，当投料比从 0.5 增大到 2.0 时，产物相对分子质量逐渐增大，这是由于 N– 马来酸酐与氨基的反应不断增加所致，但投料比高 于 2.0 后略有降低。这是因为随着投料比增大，酸酐 在反体系的浓度增大，壳聚糖长链骨架会出现断裂。
表 1 不同取代度 N-MACH 的制备
样品编号
反应时间 投料比 /h
取代度
黏度 · /mL g－1
相对分子 质量×10－4
Байду номын сангаас
M-1
0.5
1.0 0.32
560
66.8
M-2
1
1.0 0.51
635
73.3
M-3
2
1.0 0.63
705
77.4
M-4
3
1.0 0.63
700
76.2
M-5
4
1.0 0.64
收稿日期 2006–07–19；修改稿日期 – – 。 2006 09 21 基金项目 浙江省科技厅重点科研项目（No.2006C23005）。 第一作者简介 应国清（1965—），教授，主要从事生化分离、生物 制 药 、 酶 工 程 等 方 面 研 究 。 电 话 – ； – 0571 88320803 E mail 。 gqying@zjut.edu.cn
2
3.0 0.84
785
81.5
研究发现，此酰化反应为快速反应，当投料比 为 1.0 时，反应 ～ 0.5 2 h，取代度随反应时间的延长 而增大。于 2 h 基本达到反应平衡，产物取代度达 0.63。反应时间大于 2 h，取代度增大不明显。因为 吡啶是一种良溶剂，可以增进高分子的可溶性，使 酰化反应可以在黏度很大的溶液体系中进行，并保 持反应体系均相[10]。再者，吡啶是一个良好的亲核 试剂，与酸酐生成更好的酰化剂 N–酰基吡啶鎓盐。 同时，随反应时间的延长，产物相对分子质量相应 增大，并于 2 h 达到最大相对分子质量。此后延长 反应时间会导致产物糖链降解，相对分子质量降低。
蛋白质分离 。[4] 故它是一种潜在的医用生物高分 子，应用前景非常广泛，有望替代价格昂贵的透明 质酸。常见马来酸酐酰化壳聚糖（MACH）的合成 花费时间较长，反应过程会形成凝胶，后处理复 杂[5－6]，导致壳聚糖骨架断裂，产物特性黏度降低， 不利于后续应用。而目前有关 MACH 的吸湿、 保 湿性的报道也不多。为此，本文以乙酸/乙醇/吡啶 为反应介质，对壳聚糖进行 N–酰化改性，制备不 同取代度的 N-MACH，讨论了取代度与水溶性、黏 度、相对分子质量、吸湿和保湿性的关系，并用 FTIR 和 NMR 进行结构表征，为廉价的壳聚糖替代透明 质酸提供初步研究的参考数据。
： Abstract A series of N-maleyl chitosan(N-MACH) with different degrees of substitution (DS) were ， synthesized by acylation. The DS intrinsic viscosity and weight-average molecular weight of the ， products were calculated. The products were characterized with IR and NMR spectroscopy. Compared
Key words chitosan moisture-retention viscosity hyaluronic acid
壳聚糖(Chitosan，简称 CS)是自然界中惟一大 量存在的碱性多糖，由甲壳素经脱乙酰化反应生 成[1]，具有良好的成膜性、生物相容性、生物降解 性和无毒性。但壳聚糖既不溶于水也不溶于普通有 机溶剂，限制了它在化工、医药、食品、农业等领 域的广泛应用。在 CS 分子的羟基和氨基上引入活 性基团，可改善其溶解性和生物活性，这也是壳聚 糖应用开发的重要课题[2]。
SCL-10A
LC-10AS
双泵，CTO-10A 柱温箱，C-R6A 数据处理仪，色谱
柱为日本岛津 ， ； Shim-pack Diol-150 Φ7.9mm×25cm
蒸发光散射器，美国 Alltech ELSD2000 型。
1.2 N–马来酰化壳聚糖的合成
将1 g壳聚糖溶于25 mL质量分数为3%的乙酸
所以，当投料物质的量比为 2.0 时，得到相对分 子质量和黏度较高的 N-MACH。实验发现产物在水中 很快溶解。这是因为 2–羧基丁酰基的引入，破坏壳聚 糖分子内部致密晶体结构，使之成无定形态[11]，再加 上羧基本身具有亲水性，致使产物显示较佳水溶性。 2.2 取代度与吸湿保湿性能
在 25 ℃、不同相对湿度的环境中，测量 24 h 后样品的吸湿保湿性。由表 2 可知，当 CS 分子上 引入马来酰基后，吸湿性和保湿性大有改善。而且 随 DS 的增大，N-MACH 的吸湿、保湿性增大。因 为 MACH 的分子链上含有羧基，由于羧基负电荷 的排斥作用，使其分子空间伸展增大，再加上羧基 的亲水性，使 N-MACH 随 DS 的增大其结合水能力 液增大。另外由于结合在高分子中的水分子难以释 放，N-MACH 的保湿性尤为明显。
算样品特性黏度。
1.5 相对分子质量测定
采用凝胶渗透色谱法（GPC）。HPLC 流动相
0.1 mol/L 乙酸缓冲液（pH 值 5.8）；流速 1.0 ； mL/min
柱温 35 ℃。蒸发光闪射检测器柱温 120 ℃；载气
流速 3.2 L/min。标准样品为葡聚糖(峰值相对分
子质量为 × 、 × 、 × 、 × 、 4 104 9 104 41.8 104 48.2 104
with hyaluronic acid(HA) the sample with high DS value (M-11) which had high weight-average
， molecular weight and high intrinsic viscosity exhibited better moisture-absorption moisture-retention ， and antibacterial characteristics and had the potential to prepare HA-like substance. The result ： ； ； ； provided the experimental data for the widespread application of chitosan.
Synthesis and properties of novel hyaluronic acid-like chitosan
， ， ， YING Guoqing YANG Hao LI Donghua YANG Tiejun
（ ， ， ， ， ） School of Pharmacy Zhejiang University of Technolrgy Hangzhou 310014 Zhejiang China
－量11.06，00.×6V吸4e17为0湿84V流)保e，+出1湿用0体.性1普0积能3适。。测校式定正中[8]得，MGWPC为重方均程相：对lg分(M子W质)=
在密闭干燥器中，用饱和硫酸铵水溶液维持相
对湿度（RH）为 81％，用饱和碳酸钠水溶液维持
RH 为 43％，分别测量 20℃样品的吸湿性与保湿性。
溶液，加入 20 mL 无水乙醇后，再加吡啶并搅拌成
均相；将 5 mL 含一定量马来酸酐的无水乙醇溶液
搅拌下加入反应器，室温反应一定时间。产物用
250 mL 无水乙醇沉淀、离心，并分别用 150 mL 无
水乙醇洗涤 4 次，用 30 mL 蒸馏水溶解，置蒸馏水
透析 48 h，真空冷冻干燥得产物。
1.3 取代度测定[7]