血清白蛋白的分离

生化大实验

学院: 化学与生命科学专业: 生物技术

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血清白蛋白的分离、纯化与鉴定

一.实验目的

掌握血清白蛋白分离纯化的方法；

学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质的原理与操作；

学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；

学习检测蛋白质纯度的方法；

掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理和方法。

二.实验原理

1.血清白蛋白的初步分离

血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定，能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛。

可以根据不同蛋白质的相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种蛋白质。

盐析是广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就可以重新溶解。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。

奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐

2.血清白蛋白的纯化

离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。

本实验采用的是DEAE－纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β球蛋白（血清白蛋白等电点为4 . 5 ，绝大多数，α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。

3.血清白蛋白纯度及相对分子量的测定

SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。

SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原

剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。

SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异；2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。

因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。

在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-Bx （MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数）

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

该法测定蛋白质分子量的局限性：

1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，

测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。

2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。

3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。

4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。

4.血清白蛋白含量的测定

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250 -蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

三.实验步骤

1．血清白蛋白的初步分离

（1）收集血清：取5 ml血液，4 ℃，3,000 rpm离心15 min，用移液枪吸取上清（血清）1 ml至10 ml离心管，留0.1 ml （样1）至1.5 mL离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；（2）量筒量取9 ml底液，用移液管逐滴加入，在加的过程中需不断的摇晃或振荡，4 ℃静置2 h；（底液为50 %的饱和硫酸铵溶液）；

（3）4 ℃，3,000 rpm离心15 min，收集上清，留0.5 ml至1.5 ml （样2）离心管，用于测定蛋白质含量和电泳；

（4）用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（7-9滴，白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）；

（5）逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h；

（6）4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，留0.1 ml至1.5 ml离心管（样3 ），用于测定蛋白质含量和电泳；

（7）将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在；（透析袋的制备：透析袋中部有不能碰，将两条用棉线扎紧）；

（8）NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存在，需继续透析；

2．血清白蛋白的纯化

（1）装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的DEAE-纤维素装入柱内，至8-10cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）；

（2）准备60－100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节流速为1mL/min，蛋白质检测器调零；