基因克隆技术的发展

基因克隆技术的发展

摘要基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览基因克隆的理论和技术的发展创新历程，对各种技术体系，正向遗传学途径、反向遗传学途径进行了综述。随着后基因组时代的到来，基因克隆技术将发挥更加重要的作用。

关键词功能性克隆同源序列技术表达克隆技术转座子标签基因芯片电子克隆

几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标[1-2]。如何利用基因这一重要的资源，关于基因专利权的建立和完善的基因争夺大战的硝烟也正在弥漫全球。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(制药业等)，改良农作物、畜禽品种等，还可以对遗传性疾病进行基因治疗，探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。克隆基因的途径有两种，正向遗传学和反向遗传学途径。前者是依据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进行。基因的克隆一般采用下列技术：同源序列技术、差异表达基因分离技术、表达序列标签技术、转座子标签技术、基因芯片技术和电子克隆技术等。

1.功能性克隆

通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因[3]。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配

体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA3’端poly—A序列指导合成poly—T的3’端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。

2.同源性序列克隆技术

随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR 扩增，再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的DNA文库。

同源性序列克隆技术自提出以来，受到了国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题是值得重视和思考的：①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。②由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。

③基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。

3.表型克隆技术

细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生)，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。分离差异表达基因的3种基本方法为：差式筛选[4]、扣除杂交[5-7]、差异展示反转录[8]。差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取mRNA，反转录为cDNA，并构建Ts的cDNA文库，分别将从TS和RS中提取

mRNA制成cDNA探针，分别用TS和RS的eDNA探针与TScDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与Ts杂交，而不与RS杂交的克隆即为TS特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。扣除杂交则是用TS提取的mRNA反转录成cDNA探针与Rs的过量mRNA或cDNA杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS的mRNA或cDNA，将不形成杂交体的TS的eDNA纯化富集，扩增，建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库。但此法回收cDNA量有限，重复性差，灵敏度低。DDRT—PCR则是分别用Ts和RS的总mRNA 作模板，利用12个可能的锚定引物T11MN锚定mRNA的olyA末端，借助逆转录酶合成cDNA第一链，得mRNA／cDNA，再用相同的3’锚定引物和5’端随机引物分别扩增TS、RS的mRNA／cDNA，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的mRNA。分析2种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。下面就这些方法的具体过程作详细介绍。

3.1 代表性差示分析法(RDA)

代表性差示分析法(RDA)可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因，具体过程如下：①制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA即test。er eDNA和driver cDNA。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR扩增。②扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头，用过量的driver cDNA与之杂交退火，将形成三种产物：tester／tester、tester／driver、driver／driver。③特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR。3种产物中仅自身退火形成的tester／tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester／driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，Driver／driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子，再进行PCR富集特异表达cDNA片段。④对特异片段进行克隆，通过FISH等技术进一步分离特异表达基因。

3.2 抑制性差减杂交PCR法(SSH)

SSH的基本流程如下：①第1次杂交。提取TS和RS的mRNA反转录为tester eDNA