PCR、引物设计与逆转录PCR
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• PCR（Polymerase Chain Reaction) 技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外 扩增技术。
• 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学 奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以 引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃， 30 ～ 60s ）。
高温变性
低温退火
中温延伸
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
• 实际：由于引物和底物的消耗， 酶活力的下降等因素，扩增产物 的增加，逐渐由指数形式变为线 性形式，所以实际上进行30个循 环后，扩增倍数一般可达106 ～ 107。
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区 域。
1.避免PCR试剂的污染 2.最适合的反应条件 3.设置对照组：
①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。 ②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片
段代替目的模板。
③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功
进行特异性扩增的模板。
常见问题
1.为什么完全没有PCR扩增产物？
①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应 体系不完整。 ②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。 ③PCR仪温度控制不精确。 ④模板DNA发生降解。 ⑤引物或反应温度设计不合理 ⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长多
PCR扩增曲线
1.早期（E期）:引物在单链 DNA模板上搜索互补序列 ， 并与特定位点杂交。
2.中期（M期）：扩增反应 顺利进行，产物呈指数型增 长。
3.晚期（L期）：平台期， DNA聚合酶过度损耗或者产 物的抑制。
PCR扩增条件
循 环
举个例子
PC1-P20：
模板：基因组DNA；产物：506bp PCR体系（10 μL） PCR反应条件
wenku.baidu.com
常见问题
2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。 ②引物特异性差。 ③退火温度不合适。
常见问题
3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。 ②循环次数偏低。 ③模板DNA浓度过低。
常见问题
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特意扩增。
一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR 扩增效率下降或失败。
对于20bp左右的引物： Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引 物Tm值低5℃左右。
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、
cDNA，也可以使细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的
特异性；确定扩增产物长度。
➢DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动
PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。
➢缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离
由于延伸是从3’端开始的，所以不能 进行任何修饰。
普通PCR仪
温度梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
引物设计的基本原则
子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。
➢脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成
元件，包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP。
➢Mg2+、K+、增强剂
PCR的基本原理
1.变性：高温使双链DNA解离形成单链 （95℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补 区结合（45～ 65℃，30s） 。
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于 从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特 异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。
引物设计的基本原则
5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度 在55-60℃。
引物设计的基本原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补 序列。
引物自身互补——发夹结构 引物之间互补——二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个， 引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其 避免3’端的互补重叠。
引物设计的基本原则
8、引物的5’端可以修饰，3’端不可 以修饰。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会这家引物与模板杂交以及 PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区 域。 用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的注意事项
• 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学 奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以 引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃， 30 ～ 60s ）。
高温变性
低温退火
中温延伸
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
• 实际：由于引物和底物的消耗， 酶活力的下降等因素，扩增产物 的增加，逐渐由指数形式变为线 性形式，所以实际上进行30个循 环后，扩增倍数一般可达106 ～ 107。
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
引物设计的基本原则
2、避开易形成二级结构的模板序列区 域。
1.避免PCR试剂的污染 2.最适合的反应条件 3.设置对照组：
①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。 ②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片
段代替目的模板。
③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功
进行特异性扩增的模板。
常见问题
1.为什么完全没有PCR扩增产物？
①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应 体系不完整。 ②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。 ③PCR仪温度控制不精确。 ④模板DNA发生降解。 ⑤引物或反应温度设计不合理 ⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长多
PCR扩增曲线
1.早期（E期）:引物在单链 DNA模板上搜索互补序列 ， 并与特定位点杂交。
2.中期（M期）：扩增反应 顺利进行，产物呈指数型增 长。
3.晚期（L期）：平台期， DNA聚合酶过度损耗或者产 物的抑制。
PCR扩增条件
循 环
举个例子
PC1-P20：
模板：基因组DNA；产物：506bp PCR体系（10 μL） PCR反应条件
wenku.baidu.com
常见问题
2.为什么出现多条非特异性条带？
①反应体系被污染。 ②引物特异性差。 ③退火温度不合适。
常见问题
3.为什么PCR产物很少？
①聚合酶活性过低。 ②循环次数偏低。 ③模板DNA浓度过低。
常见问题
4.为什么PCR产物出现片状拖尾？
①DNA聚合酶过多或酶活性差。 ②dNTP和Mg2+浓度过高。 ③退火温度过低，PCR循环数偏多。 ④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 ⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非 特意扩增。
一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR 扩增效率下降或失败。
对于20bp左右的引物： Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）
一般情况下，PCR的最佳退火温度比引 物Tm值低5℃左右。
引物设计的基本原则
6、引物中四种碱基最好是随机分布的
避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。 特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否 则会使引物在G+C富集序列区域产生错配， 降低扩增的特异性。
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、
cDNA，也可以使细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的
特异性；确定扩增产物长度。
➢DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动
PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。
➢缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离
由于延伸是从3’端开始的，所以不能 进行任何修饰。
普通PCR仪
温度梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
引物设计的基本原则
子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。
➢脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成
元件，包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP。
➢Mg2+、K+、增强剂
PCR的基本原理
1.变性：高温使双链DNA解离形成单链 （95℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补 区结合（45～ 65℃，30s） 。
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于 从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特 异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。
引物设计的基本原则
5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度 在55-60℃。
引物设计的基本原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补 序列。
引物自身互补——发夹结构 引物之间互补——二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个， 引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其 避免3’端的互补重叠。
引物设计的基本原则
8、引物的5’端可以修饰，3’端不可 以修饰。
引物的5’端决定着PCR产物的长度，它 对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生 物素、引入点突变等。
分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会这家引物与模板杂交以及 PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区 域。 用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的注意事项