酵母活力

酵母活力——综合解决酵母性能预测的整体分析

付臣译

摘要：酵母活力测试的基础理论已经被重新考虑，并且一种新的整体分析方法被提议用于预测酿造酵母的发酵性能。在这个整体的分析方法中，特别将重点放在和不同的生长基质结合起来对酵母生理的影响。本文描述了应用此种分析的两种方法，并且推荐使用能在啤酒厂容易应用的“低技术”方法。

关键词：DNA，发酵性能，流动血细胞计数（也叫流式细胞技术），四重结构，活力，酵母

酵母活力是一个广泛的课题，并且已经有众多的文献出版。各种活力的定义包括以下内容：酵母从营养缺乏的环境转移到营养丰富的环境后，快速启动代谢的能力；承受应力仍然能完成发酵的能力；活细胞的生理状态。活性被定义为酵母发芽和生长的能力。死细胞在这定义为不能生长（在任何情况下）。

活力也被定义为细胞活跃性的延续，细胞从很活跃一直到一点也不活跃。但是，试图测定酵母活力，尤其是有关发酵性能时，困难增加。目前还不清楚在这个延续过程的哪一阶段，这个点能达到。在这个点酵母性能欠佳，结果导致不可接受的发酵特性和产品质量。因此一个新的名词：“可接受性的转折点”，被提议用来描述这个点（图1）。据认为，这个点在不同的啤酒厂之间是有所变化的。在一个啤酒厂，依据原料和工艺的变化，同一酵母有不同的表现，也能发现这个点有所变化。Cantrell 和Anderson表示，麦汁加工技术对麦汁游离脂肪酸（FFA）含量有影响，从而导致了不同的酵母游离和酯化的脂肪酸（FEFA）含量。缓慢发酵与麦汁中较低的FFA和较低的酵母FEFA有关。因此，假定认为啤酒厂处理低活力酵母的能力将依据原料的质量、酿造工艺和麦汁组成而变化。再者，已经证明麦汁的营养条件对蛋白酶A的分泌活性有重要的影响。

图1. 在酵母活力延续中，提议的“可接受的转折点”的图解表示，在这一点之后酵母

的性能将是不可接受的。这个点根据外界因素的变化而变化（注：图中

译为：可接受的性能；译

为：可接受的转折点；译为：不可接受的性能；

译为：死细胞；译为：活力损失）

额外的可变因素需要加以考虑，复制老化和最终的细胞衰老的整个影响还不是很清楚，但肯定值得关注。一个细胞走向死亡的途径被提议，在此途径中，起初细胞是健康的，后来由于承受应力（这取决于细胞所接触的环境）而死亡。假定一个走向死亡点存在，是可逆的，一旦细胞被引入一个有利的环境中，似乎它们有能力复原。

各种评论文章都已陈述，多年来许多测试都建议用来预测酵母活力，这些测试的大多数，都是依据酵母代谢的一个具体方面及大体上测量平均数。这些测试已经依据它们作用方式被广泛分类，例如监测能量水平或测量细胞内成份、发酵能力实验，细胞表面测量试验，复制方法及测量应力指示实验。

由于这些可变因素，对于不同的啤酒厂，不同的测试都有不同程度的相关性，且在某种条件下，活力预测是无效的。假定当测定酵母活力的细微差别时，一个促成因素（即特殊的麦汁-酵母组合）并没有被列入，因此尽管许多次试图设计一个测试实验，但是都没有得到一个可推荐的活力测试方法就不足为奇了。所有这些因素结合起来清楚地看出，活力测定很可能是一个活动的目标。

在本研究中，各种因素被考虑去试图和解决这种可变性。首先，我们关心的问题是现行的只测量平均数的活力测试，没有考虑数值分布，如果这个数值并没有代表一个正常的、紧密分布值，那么这个平均值就不具代表性。流式细胞技术被认为是克服这种问题的方法，流式细胞技术能依据细胞的散射和荧光特性（即一种自动荧光显微镜）来表征单个细胞。使用流式细胞方法的优点是能针对单个细胞进行测量，并且能建立出数值分布。另一个特点是，当荧光染料被加入时是很有效的。流式细胞仪已经成为一个广泛使用的工具，并且已经在酿造工业成功于测量酵母代谢的各个方面信息。第二，一个新的整体分析被研究，特别将重点放在和不同的生长基质结合起来的酵母生长潜力。所用的生长基质是不同质量的麦汁，和一种综合培养基，盐-酵母-葡萄糖-蛋白胨（MYGP）培养基。

实验

酵母准备

回收酵母从一个商业啤酒厂获得，酵母被冰镇运输并且在4℃贮存直到使用。同样新鲜的酵母泥的老化是通过在20℃保温24小时，同时以150rpm的转速进行搅拌，以减少细胞内糖原的储备。

为酵母活力测试的麦汁处理

麦汁（100ml）用0.5g的Divergan HM (一种PVPP商品名，BASF，路德维希港，德国)处理以去除金属离子，麦汁使用一个定轨摇床在4℃下以200rpm的转速摇动30分钟被混合，此麦汁事先用折叠滤纸过滤。

抑制剂添加

一种抗菌因子来源于一只0.5g 的冷冻干燥麦芽的试管标准样，在短时间内，麦芽样品用一种带有0.2mm筛的3100型锤式粉碎机粉碎成面粉细度。完全一样的5g等分试样，每一份都悬浮在30ml 0.05M的硫酸溶液中，在冰上保温3小时

后，等分试样被在4000×g离心15分钟，使用Spectro/Por 1-kDa 定点透析管，上清液用蒸馏水透析过夜。透析后用蒸馏水调节容量为45ml并在6,500 × g下离心10min，上清液等分成两份（4.5ml）并冻干，每一份都含有0.5g麦芽的浸出液。抗菌活性与含有阳离子耐热多肽的5—14-kD的蛋白存在有关，此耐热多肽能导致细胞裂解并且有一个±5的最佳PH的稳定范围。

为流式分析仪分析而进行吖啶橙的制备及酵母染色

高纯度的吖啶橙(AO, No. A 1301)从分子探针公司获得。AO有一种独特的能力去区别单链和双链核酸的染色差异，因此荧光染料能测定DNA和RNA的含量。酵母泥经稀释后以4百万/ml的浓度转接至含有50ml的MYGP肉汤培养基（每升中有3g麦芽浸膏，3g酵母浸膏，10g葡萄糖和5g的蛋白胨）或麦汁中，细胞在25℃下孵育并同时以150rpm下搅拌。每隔2小时样品被去除并在70%的乙醇中固定，然后在冰上贮存。

流式细胞分析当天，细胞经离心(2,000 × g 在4°C 下 5 min)收取以去除乙醇。细胞用9ml的盐水洗一次，然后以2百万个细胞/ml的浓度再悬浮于1ml 的盐液中。接着0.2ml的细胞被轻柔地加到0.4ml的冰冷的溶液A中（0.1%（V/V）的Triton X-100，0.08M HCl, 0.15M NaCl/磷酸盐缓冲液，10 mL 的EDTA, 和450 μL的Triton X-100），然后在冰上保持15秒。最后在接下来的2-10min的时间内，1.2ml的冰冷溶液B（AO 6 μg/mL, 1mM EDTA, 0.15M NaCl, 和磷酸-柠檬酸缓冲液, pH 6）被轻柔加入,然后用流式细胞仪进行荧光测定。

流式细胞分析

流式细胞分析用Coulter Epics Altra细胞分选仪进行，此细胞分选仪配有水冷的Coherent Innova Enterprise II 型离子激光器系统。AO在520-524nm波长下分析；光电倍增管=2；100-1000个细胞/秒；610nm带通滤波器滤除；数据被分析作为在某一特定区域内显示强荧光信号的全体平均值，或者作为X平均值（有强荧光信号的全体矩形峰的平均值）。

改良的载玻片培养或微菌落

使用改良的ASBC载玻片培养方法，经7小时（取代18小时）从微菌落的形成来评价酵母，酵母泥在盐水中稀释到大约1×106个细胞/ml 的浓度，载玻片在喷灯上烧一下，400 μL 熔化了的MYGP琼脂培养基（每升含有3g麦芽浸膏，3g酵母浸膏，10g葡萄糖和5g的蛋白胨和15g 的琼脂）以正方形形式（大约1.5×1.5cm）摊放在载玻片上。琼脂凝固后，一滴稀释的酵母悬浮液被放在琼脂上，并用一个烧过的盖玻片覆盖。载玻片在一个培养皿中25℃下孵育，2，4和7小时后在放大200倍下显微评价。活跃的生长从出芽细胞的数量来体现，并且细胞形成四重结构（不同大小的三个细胞和一个母细胞接触在一起）

短期发酵实验

稀释的酵母泥以4百万个细胞/ml的浓度，接种到装有50ml的MYGP（或麦汁）的500ml 的三角瓶中，细胞在搅拌下（150rpm）25℃孵育，4小时后等分试样被去除进行显微镜检测，在一个血球计数器的细胞室中，数200到300个细胞，记录四重结构的数量和单个出芽细胞（迟滞出芽）的数量，计算活性细胞的平均数。活性细胞% ＝（四重结构的数量和迟滞出芽的数量/细胞总数量）× 100.

结果和讨论

Axcell 和O’Connor-Cox建议整个酵母系统应当被测试，他们提出，一个合适的应力应当和活性和活力的正确评定结合起来，但是，经研究各种应力因素，