金银花叶中木犀草素的分离与鉴定(一)

金银花叶中木犀草素的分离与鉴定(一)
【摘要】目的建立一种可以从金银花叶中分离出木犀草素的方法。

方法采用超声提取，石油醚回流脱色、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的方法，通过薄层色谱、紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱进行鉴定，最终得到木犀草素产品。

结果此产品纯度最高可达81.6%，得率为28.9μg·g-1。

结论建立了从金银花叶中分离木犀草素的新工艺。

【关键词】金银花叶;木犀草素;分离;鉴定
金银花是名贵中药材，含有多种有效成分，木犀草素作为一种黄酮单体，具有抗炎、抗菌、抗癌、抑酶、抗氧化、利胆利尿等多种作用，金银花叶作为金银花的一种副产物，产量较大，而且常常被浪费掉，研究表明，金银花叶中木犀草素的含量平均是花中的2.8倍1，2]，但目前对于金银花叶中木犀草素的研究仅限于含量测定，对于木犀草素产品的分离、纯化还未见报道。

本文采用超声提取，石油醚回流脱色、大孔树脂柱和聚酰胺柱分离相结合的方法从金银花叶中分离出了黄酮单体木犀草素，并结合聚酰胺薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、高效液相色谱等方法对分离后得到的木犀草素产品进行定性鉴定和定量分析，其纯度最高可达81.6%，得率为28.9μg·g-1。

1仪器与材料
紫外-可见分光光度计UV-2450(日本岛津公司);电子分析天平;旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);Agilent1100型高效液相色谱仪，红外光谱仪FTIR-8400S(日本岛津公司)，紫外灯。

聚酰胺粉(80-100目)，木犀草素标准品(购于北京丰斯特公司)，工业酒精，其它试剂均为分析纯。

2方法
2.1木犀草素含量测定精密吸取0.100mg/ml木犀草素对照品溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml 于10ml容量瓶中，用流动相(甲醇:0.02%磷酸=50:50)定容至刻度，选择色谱柱为ZORBAXSB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Agilent公司);以甲醇:0.02%磷酸=50∶50为流动相;在检测波长350nm，柱温30℃;流速为1.0ml/min的条件下进样20.0μl。

记录峰面积，得直线回归方程为Y=33578.22C-11.807(Y代表峰面积，C代表木犀草素浓度mg/ml)，R2=0.9997;木犀草素在0.02～0.1mg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.2上柱样品的制备用20倍量的50%乙醇超声浸提黄酮后，将提取液浓缩，然后按照质量比(金银花叶和聚酰胺粉的质量)为15∶1的比例混入聚酰胺(80～100目)粉，使其保持松散，不结块，将此固体粉末取出，放在索氏提取器中用石油醚回流脱色10次后，取出此固体粉末，挥干石油醚，即得黄酮粗品拌料，然后经过物料比(黄酮粗品拌料与大孔树脂质量比)为1∶6，柱径与柱长比为1∶6的HPD100型大孔树脂柱进一步分离富集，先用2倍柱体积的蒸馏水洗掉蛋白和糖类等大分子杂质，再用70%的乙醇以最大流速洗脱，收集2～8倍柱体积的洗脱液，浓缩后得到样品。

2.3聚酰胺柱的装填把一定量的聚酰胺用水浸泡24h，湿法装柱，然后用甲醇以3BV/h的流速洗涤聚酰胺，至流出液澄清为至，再用蒸馏水洗至无甲醇。

2.4木犀草素产品的分离纯化样品上柱后开始洗脱，先用水洗去糖、蛋白分子及其它水溶性杂质，然后采用30%，50%，70%的醇溶液梯度洗脱，采用30%和50%的醇梯度洗脱时，柱中开始有淡粉色和黄色色带出现，随着洗脱的进行，淡粉色色带变得模糊，黄色色带开始缓慢下移。

当两个色带拉开一段距离后，改用70%的醇洗脱，黄色色带下移的速度加快，收集此色带从开始到流完的洗脱液，每50ml一接，记为1～9瓶。

以醋酸乙酯∶乙酸∶水=1∶1∶1为聚酰胺薄层色谱展开剂，对1～9瓶的洗脱液初步检验，发现薄层板上呈现单点，而且此点的Rf值和木犀草素标准点的Rf值相同。

然后每3瓶一合并，蒸干即可得到3个不同纯度的木犀草素产品，记为1号，2号，3号。

用甲醇对1号，2号，3号进行重结晶，得到木犀草素产品1，2，3。

3结果
对1号、2号、3号木犀草素产品进行定性鉴定和定量分析。

3.1定性分析
3.1.1颜色反应分别取3个等级的少量产品溶解在甲醇中，得到的溶液滴于滤纸上，在紫外灯下呈现深紫色，用氨水熏后，在紫外灯下观察，呈现黄色，这和木犀草素标准品的斑点显色一致。

3.1.2高效液相色谱法的鉴定把上述得到的木犀草素产品用“2.1”项的流动相溶解，定容至25ml容量瓶中，对此溶液在“2.1”项条件下进行高效液相色谱分析(以产品2为例进行说明)，发现：①整个过程中，产品色谱图呈现单峰，而且此峰的保留时间和木犀草素标准品的保留时间一致，均为Rt=13.1min。

②改变流动相，产品色谱峰的保留时间提早或者推后，并没有发生拆分;③改变检测波长为255，267，350nm，产品色谱峰没有被拆分;④加入标准品木犀草素于产品溶液中，产品中加标前后的色谱图如图1～2，结果发现，产品加标后的色谱峰保留时间不变(和标准品的一致)，只是峰增强了。

图1产品色谱图图2产品加标后色谱图由以上色谱峰可见，此类产品中木犀草素的纯度较高。