酪蛋白磷酸肽(CPP)制取、理化特性及其促铁吸收的研究

东北农业大学 硕士学位论文 酪蛋白磷酸肽(CPP)制取、理化特性及其促铁吸收的研究 姓名：牟光庆 申请学位级别：硕士 专业：动物食品科学 指导教师：骆承庠
19991101
牟光庆
摘
要
１９９９年１２月
摘要
酪蛋白磷酸肽（ｃＰｐ）是极具研究开发价值的生物活性肽。本课题对ＣＰＰ制取工艺条 件、产品检测、粗品脱苦方法、产品理化特性、促铁吸收效果等进行了全面深入的研究。
酪蛋白 “ｓｌ一酪蛋白 “靶一酚蛋白 ．』一酪蛋白
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九十年代，ＣＰＰ促进铁吸收的作用逐渐引起重视。Ｓａｉｔｏ（１９９０）“７１研究认为ＣＰＰ通过 增加无机铁的溶解性能促进铁在肠道中的吸收。Ｈｉｒｏｓｈｉ（１９９３）““在研究乳铁蛋白对铁 的吸收影响时对ＣＰＰ促铁吸收进行了研究，发现在碳酸氢钠或磷酸钠缓冲液中（ｐＨ７ ５）， 调节ｐＨ６．５～７ ４，ＣＰＰ能明显增强铁的溶解性和吸收性。１９９７。他经过进一步研究认为 ＣＰＰ促进铁在肠道中吸收的能力依赖于磷酸基团的数量，而与其分子量设有明显关 系…。
一２一
牟光庆
第一章前言
９９９年１２月
５０年代初，Ｍｅ［１ａｎｄｅｒ等”１首次用胃蛋白酶和胰酶作用于酪蛋白得到了ＣＰＰ，他们发现 在生理ｐＨ值下，ＣＰＰ的钙盐具有非常好的溶解性，并且发现，患有佝偻病的小孩服用酪蛋 白的胰酶消化液可以强化骨骼的钙化。１９５８年，Ｒｅｅｖｅｓ等ｏ’利用动物体外试验表明，ＣＰＰ 可以在中性和偏碱性条件下阻止钙的沉淀，从而促进钙在小肠中的吸收。Ｌｅｅ等”…和Ｓａ— ｔｏ（１９８６）“”也先后证明ＣＰＰ具有促进钙质吸收功能。Ｓａｔｏ用含有ＣＰＰ的食物喂养大鼠， 并在食物中加入同位素标记的钙，发现其大腿骨骼中的标记钙明显高于对照。Ｈｅａｎｃ），等 （１９９４）”１也利用放射线标记的钙让停经的妇女服用，以探讨ＣＰＰ是否具有促进钙吸收的 功效，结果显示ＣＰＰ对钙的吸收确实有正面的影响。国内张亚非等（１９９４）“２’也通过动物 试验证明，无论是低钙饲料还是基础饲料，添加一定量的ＣＰＰ后，可显著增加断乳大鼠对 钙的吸收率和储留率，但没能证明钙的利用率有显著变化。
首次探讨了通过先进的毛细管区带电泳（ｃ８ｐｉｌｌａｗ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，简称ＣＺＥ）法对 ＣＰＰ样品进行分离和含量测定的可行性。研究出适宜的电泳操作条件为：工作电压 ３０ＫＶ、柱温２５℃、毛细管长度５０ｃｍ、内径７０ｔａｎ、进样量５ｓｅｃ（气压进样）、紫外检测波长 ２００ｎｍ、运行缓冲液ｐＨ值９．２。测定ＣＰＰ含量约为５０％一５１％。“。
２．对ｃＰＰ粗制品脱苦方法进行了研究ｏｆ结果表明口一ＣＤ包埋效果不理想；３．５％粉 末状活性碳、０．５％除苦剂都能达到彻底脱苦的目的．但活性碳脱苦氮损失达１６．１％。
３．ｃＰＰ溶解性．除在ｐＨ４ ０时为９０％外，其它均高于９０％，且具有随ｐＨ值增大而增 加的特性。其泡沫体积能达到起始体积的３．８０倍，约是酪蛋白的ｌｌ倍。在ｐＨ２．０～９．０ 时，其浊度低于０．０７，具有透明度好、且随ｐＨ值升高浊度降低的特性。ＣＰＰ对热及ｃａ２＋ 具有较好的稳定性。其乳化力较酪蛋白下降了约２０％，乳化性下降２．８９％，乳化稳定性 下降１．４５倍。１ ｏ
ｌ １ ＣＰＰ的结构和功能 ｃＰＰ是以牛乳酪蛋白为原料，经单一酶或复合酶水解，再经分离而得到的含有连续磷
酸丝氨酰基和谷氮酰基的肽。酪蛋白占牛乳蛋白质的８０％，它含有％、％、Ｂ和Ｋ四种主 要成分，其比例为３４：８：３６：９，它们的一级结构已被确定。除Ｋ酪蛋白外，其余酪蛋白都 含有成簇的磷酸丝氨酰基和谷氨酰基”１。经酶消化产生的ＣＰＰ的功能区结构主要有ｍ，
由于铁本身在体内吸收的机理尚存在争议，因此有关ＣＰＰ促进铁吸收的机理至今未 见阐述。ｃＰＰ促进体外受精作用机理目前还不太清楚。
１．３ Ｃ即的制取方法
ｃＰＰ的制取方法可分为两步。第一步为酶水解，即选用合适的酶在合适的作用条件 下，把酪蛋白分子内特定的肽键打断，然后调ｐＨ至等电点４．５，使未被水解的酪蛋白沉淀 并终止反应。目前已经用多种蛋白酶消化８一酪蛋白或全酪蛋白成功地释放出 ＣＰＰ【”滔船’。第二步即选用物理或化学方法将ｃＰＰ从水解液中分离出来，再经分离纯化ｐｐｐｐ１３
３４
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可见ＣＦＰ实际是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸簇的短肽，其产品的分子量是不均一 的，其基本结构可以表示为一ＳｅｒｉＦ＇一ＳｅｒＰ—ＳｅｒＰ—Ｇｌｕ—Ｇ１ｕ一。Ｎｉｃ｝ｌｏｋ等…曾详细研究了 酪蛋白水解和ＣＰＰ释放的关系，以及有关短肽的氨基酸排列顺序。
１．利用胰蛋白酶水解酪蛋自制取ＣＰＰ。采用二次旋转回归设计研究了底物浓度为 １５％，水解１小时时酶一底物浓度比（［Ｅ］／［Ｓ］）、ｐＨ值和温度（Ｔ）三个因素对水解度（ＤＨ） 的影响，建立了数学模型。
‘以ＮＩＰ、ＣＰＰ得率为评定指标确定了最优水解工艺条件：［ＥＪ／［Ｓ］＝０．８２％、ｐＨ＝７．５ Ｔ＝４８℃、ｔ＝２ｈｒ，得出最适水解度为９ ５％及最佳分离条件：调节ｐＨ＝６．５，加ＣａＣｌ：、乙醇 后静置４—８ｈｒ所得产品ＮＩＰ摩尔比为７．５８—７．６５、ＣＰＰ得率１６．１％一１６．５％。
动物试验表明：加入硫酸亚铁和０．１％ＣＰＰ＋硫酸亚铁的饲料对贫血大鼠血红蛋白、 红细胞数及血细胞压积的影响比缺铁性饲料喂饲大鼠的血液指标有显著影响（Ｐ＜０ ０１ 或Ｐ＜Ｏ．０５）。且缺铁性贫血的大鼠血液指标恢复较好，分别达到１１２．６ ｇ／Ｌ、１５９．１ ｇ／Ｌ；７． ９４×１０８／Ｌ、８．７８×１０”／Ｌ；４０．７６％、４７ ５９％，并且ＣＰＰ和硫酸亚铁同时添加组的效果优于 添加硫酸亚铁组的效果。 下１
这些生物活性肽中，研究最多的是酪蛋白磷酸肽（Ｃａｓｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，简称ｃＰＰ）， 由于它具有很强的促钙、促铁吸收活性，在国际上倍受人们关注。日本和德国已经开发出 功能性食品上市。１９９８年，德国开发出药物，并将其列入药典。我国对其开发研究正方 兴未艾，发展前景极其广阔。
ｌ国内外ＣＰＰ研究动态
４．首次对ＣＰＰ促铁吸收进行了深入系统的研究。』体外消化试验表明ｃＰＰ能显著提 高Ｆｅｃｌ３溶液中Ｆ分＋的溶解性（Ｐ＜０ ０１），并显著促进Ｆ分＋还原为Ｆ－ｅ２＋（Ｐ＜０．０５），上述作 用受ｃＰＰ浓度和纯度影响较大，受ｐＨ值影响不显著（Ｐ＞０．０５）。加入ｃＰＰ使可溶性铁和 二价铁的透析率均显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。
——ｄ
牟光庆
第一章前言
９９９年１２月
已报道的分离纯化方法有三种。离子交换法是调节水解液的ｐＨ值至一合适值，使 ＣＰＰ带负电荷，ＮＰＰ（ｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）不带电荷，上样后ｃＰＰ吸附于离子交换剂上，用水 将不被吸附的ＮＰＰ洗出后，再选用合适的洗脱液，改变离子强度或ｐＨ值，将被吸附的ｃＰＰ 洗脱下来，从而达到将ＣＰＰ与ＮＰＰ分开的目的。“…。这种方法需选用合适的离子交换 剂．而且最终产品中含盐量较高。膜分离法是在水解液中加入一定浓度的钙离子，使ＣＰＰ 问形成交联，再选用具有台适的截留分子量的膜，用超滤法将ＣＰＰ分离出来”“。此外还 有选择沉淀法，该法是在永解液中加八一定浓度的ＣａＣｌ２，在Ｃａ２＋存在时ＣＰＰ间以钙桥形 式交联，再加入一定浓度的乙醇，改变介电常数．使ｃＰＰ交联物呈絮凝状沉淀下来而达到 与ＮＰＰ分离的目的“”。此法简单易行，但产品的纯度将受到一定影响。
（４３—５８）２Ｐ、ｄ。ｌ（５９—７９）５Ｐ、％（４６—７０）４Ｐ、口（１—２５）４Ｐ、Ｂ（１—２８）４Ｐ和ｐ（３３—４８）
ｌ∥……，见表１一ｌ。
表１—１嘲 酪蛋白经水解后所含酪蛋白磷酸ＰＺｔ（ＣＰＰ）的结构 ｎｌａｌｅ １—１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣＰＰ ａｆｔｅｒ Ｃａｓｅｉｎ ＨｙｄＭｙｓｉｓ
２立题背景与意义
铁是人体必需的营养元素之一，它是血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素以及其它呼吸酶 类的必需组成成分。其主要功能是把氧转运到组织中和在细胞氧化过程中转运电子。
Ｉ．２ ＣＰＰ的作用机理 在ＣＰＰ持钙功能的试验中发现，肠内无机磷酸盐的溶解性也提高了“…。ＣＰＰ阻止磷 酸钙沉淀的机理可以用晶体学的理论来解释，即磷酸钙在初始形成时是无定形的，然后逐
渐转变成晶体形式，ＣＰＰ粘附在其表面，阻止晶体长大。大最的肠内溶解钙不断与ＣＰＰ接 触、释放，从而使钙离子在被“保护”状态下被带到肠粘膜，免受磷酸根引力作用而沉淀，也 即ＣＰＰ阻止了磷酸钙沉淀晶体长大ｏ’。具体的吸收过程是：在十二指肠的上端，ＣＰＰ促
ＣＰＰ除具有促进钙、铁吸收的功能外，还具有其它的一些功能特性。Ｒｅｙｒｏｌｄｓ和
＇Ｉｌａｗａｉｔｓ（１９９１）…’共同证明：ｃＰＰ有明显的抗蛀牙功能。Ｎ８嘶等（１９９６）４’通过动物体外试 验进一步证明ＣＰＰ还可以明显得促进精子进入卵细胞和体外精卵细胞融合。Ｔｓｕｃｈｉｄａ等 （１９９６）０１证明ＣＰＰ还具有防止钙质丢失的作用。
关键词：酪蛋白磷酸肽水解度脱苦促铁吸收肽理化特性毛细管区带电泳
硕士学位论文
酪爱白磷酸肽（ｃｅｒ，）制取、理化特性及其促进铁吸收的研究
东北农业大学
第一章 前 言
具有生物活性的多肽，特别是短肽的发现和研究已经成为多肽类药物和功能性食品 添加剂开发和研究的热点。近年来，已经有很多具有生理活性的多肽通过蛋白消化而辨 认出来”““。这些生物活性肽都以非活性状态存在于蛋白质的长链之中，当用适当的蛋 白酶水解时，它们的活性就被释放出来。
在对由体外酶水解制得的ＣＰＰ的功能性质进行研究的同时，许多研究者从饲喂酪蛋 白的动物肠道内分离ＣＰＰ，并对其一级结构和功能性质进行分析研究。Ｎａｉｔｏ等“”最早用 含有酪蛋白的配合饲料饲喂大鼠，间隔一定时间后从肠内容物中分离到ｃＰＰ，将此来源的 ＣＰＰ和用胰蛋白酶水解得到的ＣＰＰ作比较后发现，在３７℃下从体内分离的ＣＰＰ比在体外 水解得到的ＣＰＰ阻止磷酸钙沉淀的作用更明显。Ｌｅｅ等“”用结扎肠环法进行了活体钙啦 收试验，结果表明摄人酪蛋白的大鼠比摄入其它蛋白的大鼠吸收了更多的钙，并推算出肠 内数微摩尔的ＣＰＰ即可阻止４０～１００倍的钙沉淀。Ｍｅｉｓｅｌ等“”用酪蛋白饲喂小猪后，从 小猪的小肠内分离得到结构为ｑ．（６６—７４）的ｃＰＰ。Ｈｉｒａｙａｍａ等“６’从饲喂ＣＰＰ的大鼠小肠 内分离得到结构为。。。（６ｌ一６７）和０（７—２０）的ＣＰＰ。可见，与体外水解得到的ＣＰＰ相比，体 内分离得到的ｃＰＰ肽链较短，但二者含有相厨的核心部分，且具有相似的功能性质““。 动物体摄人含有酪蛋白的食物后，在肠道蛋白酶作用下，可生成具有促进钙吸收功能的 ＣＰＰ，这被认为是乳及乳制品中的钙具有较高的生物可利用性的原因之一”“。
得到Ｃ即成品的过程。图Ｉ—Ｉ为ＣＰＰ的制取工艺。
酪蛋白
酶
水解液
厂——上；蛩方法分离
图Ｉ—Ｉ ＣＰＰ制取工艺
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酶水解反应主要有连续和不连续两种方法。连续的酶解反应在膜反应器内进行，该 反应器除要求有喂料泵、反应罐、ｐＨ控制仪、自动加碱装置、滤膜以外，还要求滤膜能够有 效地截留酶分子，并有足够长的使用寿命”】【矗】，整个反应在连续循环状态下进行，反应用 酶也连续循环使用。不连续反应即在反应罐内分批进行。酶水解完成后调节反应物的 ｐＨ值至等电点，终止酶反应，再用离心或过滤方法把水解液中失活的酶分子和变性的酪 蛋白与水解产物分开“”。
一３一
硬士学位论文醣蛋白磷酸肽（ｃ开）榭取、理化特性及其促进铁吸收的研究
东北农业大学
使钙以主动方式吸收；在回肠及小肠末端则以被动方式吸收哺），ＣＰＰ促进钙的吸收以后 一种方式为主。
ｃＰＰ抗蛀牙的机理为：ＣＰＰ的磷酸丝氨酸簇结合钙以后，以非结晶的形式定位在牙蚀 部位，磷酸丝氨酸的钙盐提供自由的ｃａ２＋和ＰＯ，“缓冲液．从而有效地防止牙蚀细菌的侵 蚀和造成的脱矿物质过程。