代谢控制发酵-第六章 代谢控制发酵实例
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Ø 选育单氟乙酸、三氟乙酸敏感突变株 抑制乌头酸梅和异柠檬酸脱氢酶活性。若菌体对药品 敏感，说明该突变株的乌头酸酶和异柠檬酸酶活力低或 含量少
Ø 选育强化CO2固定反应的突变株 氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆
Ø 强化柠檬合成酶
一、柠檬酸发酵
发酵控制
Ø 控制Mn2+和NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP 畅通无阻
Ø 黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低，它 被葡萄糖和NH4＋抑止（第二个特点）
一、柠檬酸发酵
TCA循环的调节
一、柠檬酸发酵
wenku.baidu.com
代谢调节
氧对柠檬酸积累的调节
Ø 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重 新氧化时所需
Ø 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导 致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少
一、柠檬酸发酵
发酵产率
无CO2固定反应的产率
有CO2固定反应的产率
理论产率为： 192/(180×1.5)=71.1%
理论产率为： 192/180=106.7%
一、柠檬酸发酵
代谢调节
糖酵解及丙酮酸代谢的调节
Ø 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用， 而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用
酶
酶
酶
复活
酶
不可逆
丝氨酸
酶
诱变 eg. UV
苯丙
氨酸 解除
酶 抑制
p 氨基苯甲酸合成酶TrpE第40位Ser突变为Phe后，色氨酸对 该酶的反馈抑制作用被解除(Caligiuri, 1991)
选育抗结构类似物突变株机理 p 结构类似物是指那些与正常代谢产物结构相似，并且具有与
之同等的与阻遏物或变构酶相结合的能力的物质 p 它们与阻遏物或变构酶的结合是不可逆的，这就使得有关酶
型突变株 思考：这样做有什么不足？
(2) 选育渗漏缺陷型突变株 苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷(或预苯酸缺陷)使得菌株生长
缓慢，因此可选育预苯酸渗漏缺陷型突变株 渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末
端产物，因而可以避开反馈调节 但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成 在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，
Ø 控制Fe2+浓度，使顺乌头酸水合酶失活 Ø 控制pH<3，pH碱性，草酸增加；pH中性，葡萄糖酸增
加 Ø 加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶
二、L-色氨酸发酵
生物合成途径
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径 代谢流(通) 解除色氨酸的阻遏和弱化作用
p 敲除trpR基因，解除关键酶受到的反馈阻遏 p 敲除弱化子，去除弱化作用 p 替换为不受反馈阻遏的启动子
Ø 耐高柠檬酸且不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸 后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变 株
一、柠檬酸发酵
代谢控制育种
Ø 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然 会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子 的形成
丙酮酸
采用半乳糖透过酶(glf)-葡萄糖激酶(glk)介 导的葡萄糖转运替代原有葡萄糖转运系统
非PTS依赖的 葡萄糖
半乳糖透过酶
葡萄糖
葡萄糖激酶
葡萄糖转运系 (胞外)
（胞内）
统
6-磷酸葡萄糖
色氨酸输入
色氨酸输出
p 增强色氨酸输出(出) 阻断输入：敲除(knock out)aroP 强化输出：过表达(overexpress)yddG
胞内渗透到细胞外
三、鸟苷发酵
育种策略
Ø 阻断或减弱支路代谢，增加前体物的合成 ü 选育转酮酶缺陷的突变株 ü 选育莽草酸缺陷突变株 ü 选育腺嘌呤缺陷突变株 ü 选育5'-核苷酸酶活性微弱的菌株 ü 选育GMP还原酶活性丧失或微弱的菌株 ü 选育组氨酸缺陷突变株 ü 选育硫胺素（VB1）缺陷突变株 ü 克隆合成途径关键酶基因
不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用被不可逆的抑制 p 将结构类似物作为选择压力进行突变株的选育，得到的抗结
构类似物突变株的变构酶 p 该酶不能够与代谢产物结合，从而解除其反馈抑制或反馈阻
遏作用
(2) 选育色氨酸缺陷型回复突变株
色氨酸 丝氨酸
丝氨酸
R C
R：调节亚基 C：催化亚基
解除反 馈抑制
突变 失活
谢 谢！
弱化子
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径代谢流(通) 解除色氨酸抑制作用：
(1) 选育色氨酸结构类似物(5-氟色氨酸、5-甲基色氨酸) 抗性突变株
变构，失活
酶
色氨酸
问题：诱变后存活的微生物 包括正向突变(想要的)、负 向突变(不想要的)，怎么把 正向突变的筛选出来？
5-氟色氨酸 5-甲基色氨酸
四、青霉素发酵
育种策略
Ø 增加前体物供给 ü 选育缬氨酸对乙酰羟酸合成酶抑制程度低的菌株 ü 克隆同型柠檬酸合成酶基因，增加α-氨基己二酸的量 ü 克隆青霉素G酰化酶基因，强化青霉素生物合成能力 Ø 选育细胞膜渗透性好的突变株 ü 产黄青霉菌如果膜渗透性发生改变，使其摄取无机硫酸
盐的能力提高
四、青霉素发酵
Ø 碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键
四、青霉素发酵
代谢调节
赖氨酸的反馈调节
Ø α-氨基己二酸的初级代谢产物是赖氨酸，分支次级代 谢产物是青霉素
Ø 赖氨酸能抑制青霉素的合成，α-氨基己二酸能逆转这 种抑制
Ø 赖氨酸能反馈抑制高柠檬酸合成酶，导致α-氨基己二 酸合成受阻，因而减少青霉素的合成
四、青霉素发酵
赖氨酸的反馈调节
代谢调节
四、青霉素发酵
其它反馈调节
代谢调节
Ø 产黄青霉生物合成青霉素能被高浓度的铵离子抑制， NH4+还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达
Ø 磷酸盐可强化产黄青霉的葡萄糖阻遏 Ø 硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素
合成中起着重要作用。高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青 霉菌株的硫酸盐通透酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时， 该酶活性及硫酸盐摄取率上升
概率低！
R C
不能合成 色氨酸
色氨酸缺 陷型(Trp-)
苯丙 氨酸
R C
回复突变
色氨酸 不缺陷
选育营养缺陷型回复突变株原理 当菌株因别构酶突变失活时(哪个亚基突变引起，调节亚基
还是催化亚基？)，会引起营养缺陷。若产生回复突变(往往是 表现型回复突变，为什么？)，这时有某种可能(概率很低，另 外还有其他可能，可讨论)：
四、青霉素发酵
育种策略
Ø 解除反馈调节作用 ü 选育三氟亮氨酸，正缬氨酸，L-烯丙基甘氨酸等抗性突
变株 ü 选育自身耐受性突变株 ü 选育α-氨基己二酸缺陷的回复突变株 ü 选育半胱氨酸、异亮氨酸或苏氨酸缺陷的回复突变株 ü 选育苯乙酸，苯乙酰胺抗性突变株 Ø 阻断支路代谢 ü 选育亮氨酸营养缺陷型 ü 选育赖氨酸营养缺陷型
Ø 当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼 吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降
一、柠檬酸发酵
代谢控制育种
Ø 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2%的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
Ø 显色圈大的菌株 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好
二、L-色氨酸发酵
育种策略
进、通、节、堵、出
三、鸟苷发酵
生物合成途径
三、鸟苷发酵
代谢调节
三、鸟苷发酵
育种策略
Ø 解除反馈调节作用 ü 选育抗鸟嘌呤结构类似物的突变株 ü 选育抗腺苷及腺嘌呤结构类似物的突变株 Ø 消除或减弱鸟苷的进一步代谢 ü 选育不分解利用鸟苷的菌株 ü 选育核苷磷酸化酶活性弱的菌株 Ø 选育核苷膜透过性强的菌株，使合成的鸟苷不断从细
四、青霉素发酵
生物合成途径
四、青霉素发酵
代谢调节
碳分解代谢产物的影响
Ø 青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如ACV合成 酶，IPN合成酶，酰基转移酶就被阻遏
Ø 葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为赖氨酸和青霉素合 成中间体的α-氨基己二酸转向合成赖氨酸，抑制青霉 素的合成
Ø 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄 糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于合成青 霉素的中间产物。
代谢控制发酵
Metabolic Control Fermentation
第六章 代谢控制发酵实例
1
柠檬酸发酵
2
L-色氨酸发酵
3
鸟苷发酵
4
青霉素发酵
一、柠檬酸发酵
黑曲霉柠檬酸 生物合成途径
一、柠檬酸发酵
生物合成途径
Ø 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、 HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另 一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生 成柠檬酸
发酵控制
Ø 乳糖是最好的碳源，葡萄糖也较好，但需控制其加入的 浓度，因为高浓度的葡萄糖对一些酶具有阻遏作用。常 采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖
Ø 侧链前体物质应少量多次补入，控制在亚抑制水平（供 应速率略大于生物合成需要），以减少前体的氧化，提 高前体结合到产物中的比例
Ø 采取变温控制。生长阶段温度较高，缩短生长时间；合 成阶段适当降低温度，以利于青霉素的合成，减少青霉 素降解
催化亚基回复突变+调节亚基突变 调节亚基突变后，使得终产物不能够与其结合，反馈抑制作 用被解除
p 增强前体物丝氨酸合成(通) 克隆丝氨酸（色氨酸合成前体
物）合成途径上的关键酶基因serA
p 增强前体物丝氨酸合成(通) 过量表达基因aroG，提高
DAHP合成酶（DS）活性
p 阻断分支酸向预苯酸的代谢(节) (1) 选育苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷
Ø 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离 子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬 酸不敏感
Ø 锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白 合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高 铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的
一、柠檬酸发酵
糖酵解的代谢调节
一、柠檬酸发酵
就能积累所需的产物
p 阻断色氨酸代谢为吲哚(堵) (1) 敲除tnaA基因 (2) 选育不能在以色氨酸为唯一碳
源的培养基(属于哪种培养基？) 上生长的突变株
影印法示意图
丰富培养基
1
诱变
23
以Trp为唯一碳 丰富培养基 /氮源的培养基
p改变葡萄糖的运输途径(进) 思考：葡萄糖如何运输？
磷酸烯醇 式丙酮酸
Ø 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP : HMP = 2 : 1， 后者EMP : HMP = 4 : 1
Ø 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料 发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱
Ø 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸 烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以 丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主
代谢调节
TCA循环的调节
Ø TCA环的起始酶--柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑 曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA 环的第一个特点
Ø 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件， 顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0时失活。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平 衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
Ø 选育强化CO2固定反应的突变株 氟丙酮酸敏感、天冬氨酸缺陷、羧化酶基因克隆
Ø 强化柠檬合成酶
一、柠檬酸发酵
发酵控制
Ø 控制Mn2+和NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，使EMP 畅通无阻
Ø 黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低，它 被葡萄糖和NH4＋抑止（第二个特点）
一、柠檬酸发酵
TCA循环的调节
一、柠檬酸发酵
wenku.baidu.com
代谢调节
氧对柠檬酸积累的调节
Ø 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重 新氧化时所需
Ø 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导 致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少
一、柠檬酸发酵
发酵产率
无CO2固定反应的产率
有CO2固定反应的产率
理论产率为： 192/(180×1.5)=71.1%
理论产率为： 192/180=106.7%
一、柠檬酸发酵
代谢调节
糖酵解及丙酮酸代谢的调节
Ø 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用， 而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用
酶
酶
酶
复活
酶
不可逆
丝氨酸
酶
诱变 eg. UV
苯丙
氨酸 解除
酶 抑制
p 氨基苯甲酸合成酶TrpE第40位Ser突变为Phe后，色氨酸对 该酶的反馈抑制作用被解除(Caligiuri, 1991)
选育抗结构类似物突变株机理 p 结构类似物是指那些与正常代谢产物结构相似，并且具有与
之同等的与阻遏物或变构酶相结合的能力的物质 p 它们与阻遏物或变构酶的结合是不可逆的，这就使得有关酶
型突变株 思考：这样做有什么不足？
(2) 选育渗漏缺陷型突变株 苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷(或预苯酸缺陷)使得菌株生长
缓慢，因此可选育预苯酸渗漏缺陷型突变株 渗漏缺陷型是一种不完全营养缺陷型，它不会产生过量的末
端产物，因而可以避开反馈调节 但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成 在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，
Ø 控制Fe2+浓度，使顺乌头酸水合酶失活 Ø 控制pH<3，pH碱性，草酸增加；pH中性，葡萄糖酸增
加 Ø 加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶
二、L-色氨酸发酵
生物合成途径
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径 代谢流(通) 解除色氨酸的阻遏和弱化作用
p 敲除trpR基因，解除关键酶受到的反馈阻遏 p 敲除弱化子，去除弱化作用 p 替换为不受反馈阻遏的启动子
Ø 耐高柠檬酸且不分解柠檬酸的菌株 不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸 后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。 方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变 株
一、柠檬酸发酵
代谢控制育种
Ø 选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株 在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然 会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子 的形成
丙酮酸
采用半乳糖透过酶(glf)-葡萄糖激酶(glk)介 导的葡萄糖转运替代原有葡萄糖转运系统
非PTS依赖的 葡萄糖
半乳糖透过酶
葡萄糖
葡萄糖激酶
葡萄糖转运系 (胞外)
（胞内）
统
6-磷酸葡萄糖
色氨酸输入
色氨酸输出
p 增强色氨酸输出(出) 阻断输入：敲除(knock out)aroP 强化输出：过表达(overexpress)yddG
胞内渗透到细胞外
三、鸟苷发酵
育种策略
Ø 阻断或减弱支路代谢，增加前体物的合成 ü 选育转酮酶缺陷的突变株 ü 选育莽草酸缺陷突变株 ü 选育腺嘌呤缺陷突变株 ü 选育5'-核苷酸酶活性微弱的菌株 ü 选育GMP还原酶活性丧失或微弱的菌株 ü 选育组氨酸缺陷突变株 ü 选育硫胺素（VB1）缺陷突变株 ü 克隆合成途径关键酶基因
不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用被不可逆的抑制 p 将结构类似物作为选择压力进行突变株的选育，得到的抗结
构类似物突变株的变构酶 p 该酶不能够与代谢产物结合，从而解除其反馈抑制或反馈阻
遏作用
(2) 选育色氨酸缺陷型回复突变株
色氨酸 丝氨酸
丝氨酸
R C
R：调节亚基 C：催化亚基
解除反 馈抑制
突变 失活
谢 谢！
弱化子
p 解除反馈调节，增强色氨酸合成途径代谢流(通) 解除色氨酸抑制作用：
(1) 选育色氨酸结构类似物(5-氟色氨酸、5-甲基色氨酸) 抗性突变株
变构，失活
酶
色氨酸
问题：诱变后存活的微生物 包括正向突变(想要的)、负 向突变(不想要的)，怎么把 正向突变的筛选出来？
5-氟色氨酸 5-甲基色氨酸
四、青霉素发酵
育种策略
Ø 增加前体物供给 ü 选育缬氨酸对乙酰羟酸合成酶抑制程度低的菌株 ü 克隆同型柠檬酸合成酶基因，增加α-氨基己二酸的量 ü 克隆青霉素G酰化酶基因，强化青霉素生物合成能力 Ø 选育细胞膜渗透性好的突变株 ü 产黄青霉菌如果膜渗透性发生改变，使其摄取无机硫酸
盐的能力提高
四、青霉素发酵
Ø 碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键
四、青霉素发酵
代谢调节
赖氨酸的反馈调节
Ø α-氨基己二酸的初级代谢产物是赖氨酸，分支次级代 谢产物是青霉素
Ø 赖氨酸能抑制青霉素的合成，α-氨基己二酸能逆转这 种抑制
Ø 赖氨酸能反馈抑制高柠檬酸合成酶，导致α-氨基己二 酸合成受阻，因而减少青霉素的合成
四、青霉素发酵
赖氨酸的反馈调节
代谢调节
四、青霉素发酵
其它反馈调节
代谢调节
Ø 产黄青霉生物合成青霉素能被高浓度的铵离子抑制， NH4+还能直接阻遏产黄青霉的青霉素合成基因的表达
Ø 磷酸盐可强化产黄青霉的葡萄糖阻遏 Ø 硫酸盐作为前体氨基酸半胱氨酸合成酶原料，在青霉素
合成中起着重要作用。高浓度的硫酸盐阻遏低产产黄青 霉菌株的硫酸盐通透酶而影响摄取，在硫酸盐饥饿时， 该酶活性及硫酸盐摄取率上升
概率低！
R C
不能合成 色氨酸
色氨酸缺 陷型(Trp-)
苯丙 氨酸
R C
回复突变
色氨酸 不缺陷
选育营养缺陷型回复突变株原理 当菌株因别构酶突变失活时(哪个亚基突变引起，调节亚基
还是催化亚基？)，会引起营养缺陷。若产生回复突变(往往是 表现型回复突变，为什么？)，这时有某种可能(概率很低，另 外还有其他可能，可讨论)：
四、青霉素发酵
育种策略
Ø 解除反馈调节作用 ü 选育三氟亮氨酸，正缬氨酸，L-烯丙基甘氨酸等抗性突
变株 ü 选育自身耐受性突变株 ü 选育α-氨基己二酸缺陷的回复突变株 ü 选育半胱氨酸、异亮氨酸或苏氨酸缺陷的回复突变株 ü 选育苯乙酸，苯乙酰胺抗性突变株 Ø 阻断支路代谢 ü 选育亮氨酸营养缺陷型 ü 选育赖氨酸营养缺陷型
Ø 当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼 吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降
一、柠檬酸发酵
代谢控制育种
Ø 透明圈大的菌株 平板：10%甘薯 + 2%的琼脂 + 0.5% CaCO3 诱变后，涂布，透明圈大的则好
Ø 显色圈大的菌株 平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好
二、L-色氨酸发酵
育种策略
进、通、节、堵、出
三、鸟苷发酵
生物合成途径
三、鸟苷发酵
代谢调节
三、鸟苷发酵
育种策略
Ø 解除反馈调节作用 ü 选育抗鸟嘌呤结构类似物的突变株 ü 选育抗腺苷及腺嘌呤结构类似物的突变株 Ø 消除或减弱鸟苷的进一步代谢 ü 选育不分解利用鸟苷的菌株 ü 选育核苷磷酸化酶活性弱的菌株 Ø 选育核苷膜透过性强的菌株，使合成的鸟苷不断从细
四、青霉素发酵
生物合成途径
四、青霉素发酵
代谢调节
碳分解代谢产物的影响
Ø 青霉素的生物合成受碳分解代谢产物阻遏，如ACV合成 酶，IPN合成酶，酰基转移酶就被阻遏
Ø 葡萄糖可以刺激菌体生长，使作为赖氨酸和青霉素合 成中间体的α-氨基己二酸转向合成赖氨酸，抑制青霉 素的合成
Ø 葡萄糖降低青霉素生物合成的速率和得率还由于葡萄 糖与6-APA之间形成复合物，从而减少了可用于合成青 霉素的中间产物。
代谢控制发酵
Metabolic Control Fermentation
第六章 代谢控制发酵实例
1
柠檬酸发酵
2
L-色氨酸发酵
3
鸟苷发酵
4
青霉素发酵
一、柠檬酸发酵
黑曲霉柠檬酸 生物合成途径
一、柠檬酸发酵
生物合成途径
Ø 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、 HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另 一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生 成柠檬酸
发酵控制
Ø 乳糖是最好的碳源，葡萄糖也较好，但需控制其加入的 浓度，因为高浓度的葡萄糖对一些酶具有阻遏作用。常 采用连续添加葡萄糖的方法代替乳糖
Ø 侧链前体物质应少量多次补入，控制在亚抑制水平（供 应速率略大于生物合成需要），以减少前体的氧化，提 高前体结合到产物中的比例
Ø 采取变温控制。生长阶段温度较高，缩短生长时间；合 成阶段适当降低温度，以利于青霉素的合成，减少青霉 素降解
催化亚基回复突变+调节亚基突变 调节亚基突变后，使得终产物不能够与其结合，反馈抑制作 用被解除
p 增强前体物丝氨酸合成(通) 克隆丝氨酸（色氨酸合成前体
物）合成途径上的关键酶基因serA
p 增强前体物丝氨酸合成(通) 过量表达基因aroG，提高
DAHP合成酶（DS）活性
p 阻断分支酸向预苯酸的代谢(节) (1) 选育苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷
Ø 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离 子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬 酸不敏感
Ø 锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白 合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高 铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的
一、柠檬酸发酵
糖酵解的代谢调节
一、柠檬酸发酵
就能积累所需的产物
p 阻断色氨酸代谢为吲哚(堵) (1) 敲除tnaA基因 (2) 选育不能在以色氨酸为唯一碳
源的培养基(属于哪种培养基？) 上生长的突变株
影印法示意图
丰富培养基
1
诱变
23
以Trp为唯一碳 丰富培养基 /氮源的培养基
p改变葡萄糖的运输途径(进) 思考：葡萄糖如何运输？
磷酸烯醇 式丙酮酸
Ø 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP : HMP = 2 : 1， 后者EMP : HMP = 4 : 1
Ø 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料 发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱
Ø 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸 烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以 丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主
代谢调节
TCA循环的调节
Ø TCA环的起始酶--柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑 曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA 环的第一个特点
Ø 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件， 顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0时失活。顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平 衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7