引物设计

查找引物的几种途径

•1：引用高影响因子的文献。•2：在线设计软件。

•3：一些引物库。

•4：引物设计软件。如Primer，Oligo，DNA star等。

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/

/primerbank/

引物设计的步骤

•1：PUBMED查找目的基因序列。•2：软件查找引物。

•3：按照实验要求修饰引物。•4：在PUBMED上BLAST分析同源性。

引物设计的原则

•1：引物的长度（primer length）。

•2：产物的长度（product length）。

•3：引物的3’端和5’端。

•4：引物序列的GC含量（GC composition）。

•5：引物的二聚体和发夹结构（duplex formation and hairpin）。

•6：引物的Tm值。

•7：错误引发位点（false priming site）

•8：引物的特异性

1：PUBMED查找目的基因序列

c DNA序列

DNA 序列

点击CDS后得到cDNA序列

2：软件查找引物

自动搜索功能引物分析功能

符合要求的引物

查询引物酶切位点

引物自身形成发夹结构

引物自身形成二聚体

引物之间形成二聚体

结果保存

3：引物的修饰

4：BLAST分析同源性

/blast/Bl

ast.cgi

填入引物序列

选择种属

表明上游引物与这些序列匹配的得分在

40分以下

mRNA

基因组

表明引物序列与转录mRNA和基因组的

匹配度

提供一些同源性的具体信息

•1：引物的长度一般为16-30bp，一般比较常用的是18-27bp，长度太短容易导致产物的特异性不高，导致非特异性产物。引物长度大于38会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。•2：产物长度为300~600碱基对，过小则不容易和引物二聚体区分开，不利于后面的实验。而过长一方面增加错配的几率，一方面会增加延伸时间。

•3：引物的3’端和5’端。引物的5’端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛。而引物的3’端则要求比较高（1）3’端相似性较高的序列，容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或

CCC，也会使错误引发机率增加。（2）引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。（3）引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

•4：引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

•5：引物的二聚体和发夹结构。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性一般不要超过4.5kcal/mol，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。

•6：ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

•7：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度。

Tm=2(A+T)+4(C+G)

•8：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源