黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化

黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化
摘要
柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。

可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。

实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。

在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。

结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。

另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。

关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶
Abstract
Citric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate
1. 课题背景
1.1柠檬酸简介[1]
柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠
檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸（2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid）。

分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13）
物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。

极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。

化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。

加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。

柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

1.2柠檬酸用途[2]
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等[3]。

柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。

1.3柠檬酸循环（citric acid cycle）[4]
又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），克雷布斯循环(Krebs cycle)。

体内物质糖、脂肪或氨基酸有氧氧化的主要过程。

通过生成的乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成三羧酸（柠檬酸）开始，再通过一系列氧化步骤产生CO2、NADH及FADH2，最后仍生成草酰乙酸，进行再循环，从而为细胞提供了降解乙酰基而提供产生能量的基础。

由克雷布斯（Krebs）于20世纪30年代最先提出。

1.4实验发酵机理
1）以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌（我们采用黑曲霉M288）糖化后产生高浓度的葡萄糖。

2）、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以EMP（糖酵解途径或者）、HMP（磷酸戊糖循环）两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。

3）生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调的结果。

1）Mn2+抑制蛋白质合成造成NH4+的浓度增大，从而解除对PFK的抑制，使EMP通畅；2）柠檬酸脱氢酶在柠檬酸浓度高的情况下活性降低，进一步促进柠檬酸的积累。

1.5发酵方法[2]
发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。

固态发酵是以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。

采用固态发酵生产柠檬酸，设备简单，操作容易。

液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。

发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。

深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。

微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。

现多采用通用发酵罐。

它的主要部件包括罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。

发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。

除通用式发酵罐外，还可采用带升式发酵罐、塔式发酵罐和喷射自吸式发酵罐等。

为了得到产柠檬酸的优良菌种，通常是从不同地区采集的土壤或从腐烂的水果中分离筛选，然后通过物理和化学方法进行菌种选育。

例如薯干粉深层发酵柠檬酸的菌种就是通过柠檬酸不断变异和选育得到的。

菌种适合在高浓度下发酵，产酸水平较高。

1.6黑曲霉菌柠檬酸发酵的影响因素[2]
柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。

一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。

温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。

微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。

通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。

随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。

采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。

柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。

尽管经过几十年的研究[5]，关于柠檬酸发酵机制仍然有很多不够了解的地方，柠檬酸的合成积累涉及到一系列的酶，它们是相互关联的，影响制约柠檬酸发酵的因子也是多种多样的，发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸率的降低，铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。

柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。

然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。

相对来说，发酵培养基中的金属离子以及小分子量的有机物是比较容易控制的因子。

但是每种因子的影响不是绝对的，如金属离子Fe2+、Mn2+等，他们并不是可以无条件降低其浓度，同时它们也是微生物其它正常代谢途径中必须因子，我们只能寻找一个最合适于柠檬酸发酵的浓度。

资料表明[6][7][8][9]：高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利于合成柠檬酸。

铜离子能抑制柠檬酸裂解酶活力[6]，培养基中加Cu2+，有利于达到最高柠檬酸产量。

柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下转化为顺乌头酸，进而转化为异柠檬酸，Fe2+是乌头酸水合酶专一激活剂，但柠檬酸发酵开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准备，随后要控制Fe2+的存在才能开始并大量积累柠檬酸。

Johnson等在研究黑曲霉的CO2固定作用时发现有两个CO2固定系统，这两个系统需要Mg2+、K +[7][11][12]。

也有说几种常见的金属离子对柠檬酸合成酶的抑制作用，且Ca2+> Mg2+ >Na+ >K+，当然还与离子强度有关。

AMP、无机磷和NH4+对磷酸果糖激酶(PFK)有活化作用，NH4+还能有效的解除柠檬酸和ATP对其抑制，NH4+的浓度和柠檬酸生产速度有密切关系[10]。

发酵过程中加入甲醇能明显提高柠檬酸产量[1][3]。

其可能的机理为：甲醇抑制a一酮戊二酸脱氢酶活力，提高丙酮酸羧化酶的活力，增加柠檬酸穿过细胞膜能力，降低胞内柠檬酸浓度，促进柠檬酸的合成，甲醇还能抑制柠檬酸裂解酶的活力。

同时发现，甲醇对细胞有一定毒性影响。

据报道[6]，某些氨基酸，B族维生素和生物素也能提高柠檬酸产量，另有多种化合物，如NaF、乙二胺四乙酸钠等，也能增加柠檬酸积累，还有植酸、植酸钠、物理因素能提高柠檬酸产量。

2. 课题意义
我国柠檬酸的生产现状：我国是世界柠檬酸生产大国，总产量居世界前列。

近年来，由于我国柠檬酸生产能力和出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重供大于求局面。

我国柠檬酸生产以薯干为原料的深层发酵技术具有独创性，发酵指数处世界前列，产品在国际市场具有一定竞争力。

但我国提取工艺和设备水平落后，生产单耗高，收率低，产品质量不高，规模效益差，深度产品开发少，废渣废水污染严重[13][14]。

针对这些问题，国内目前有很多人研究了MgCl2[12]、普鲁兰酶[15]、植酸钠[16]、磷浓度[17]、菌种[18]、木薯原料[19]、
纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比[20]、溶解氧[21]、发酵罐搅拌系统[22]、尿素、乙醇等添加剂[23]、初始含糖量、温度、PH、发酵时间[24]等等对黑曲霉发酵产酸的影响，也有大量的研究探究了柠檬酸生产废渣栽培平菇[25]厌氧发酵生产沼气[26]制取糖化酶等综合利用、废水循环利用和治理[27]等。

通过前期阅读大量的文献，我们发现几乎所有相关的探究实验中的发酵步骤都是通过摇瓶发酵完成的，但是实罐发酵与摇瓶发酵的发酵历程是否真的一致并无可靠证据，而且目前少有分析实罐发酵与摇瓶发酵变化规律的联系的研究，于是我组决定以探究硫酸铵浓度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响为例，实罐发酵与摇瓶发酵变化规律的联系，探究绘制实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度、菌浓度、残糖、PH值等各参数的变化曲线并进行对比，从而分析实罐发酵与摇瓶发酵的规律的异同，为其他人的后续研究提供一些参考。

然后，进行摇瓶发酵探究硫酸铵浓度对发酵的影响之后与其他人的研究结果比较。

之后，再进行实罐发酵，进行验证和修正，从而获得对实际工业生产具有指导意义的实罐发酵的最适硫酸铵浓度参数。

3. 工作内容
3.1 实验菌株
黑曲霉柠檬酸生产菌株M228。

3.2 主要仪器
电子天平、生化培养箱、10L机械搅拌式发酵罐、配套设备（空压机、过滤器、蒸汽发生器等）、立式灭菌锅、恒温水浴锅、血球计数板和显微镜、台式高速离心机、碱式滴定装置、离心机、电磁炉。

3.3 种子培养
茄形瓶斜面培养扩大制备孢子。

马铃薯培养基，35℃恒温培养箱培养3~4天。

标准糖液中加入0.5%的硫酸铵，八层纱布封口，121℃灭菌20min，用无菌移液管吸取25mL无菌水至茄形瓶斜面内，并用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下孢子，摇匀后倒入已冷却好的100mL 的种子培养基内，包扎好后摇床35℃、200r/min培养20h[17]。

3.4 培养条件[1]
3.4.1糖化清液
细度为40目以上玉米粉15g与100mL去离子水混合调成浆乳，调节pH为5.5-6.0，加热并搅拌升温至（65±1）℃，按20U/g原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持60min，液化15min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色，即糖化完全。

四层纱布过滤于250ml三角瓶即得糖化清液。

3.4.2 摇瓶发酵培养
标准糖液100ml，加入硫酸铵后于121℃灭菌20min，冷却至室温，接种。

摇床35℃、200r/min培养。

3.4.3 实罐发酵培养
玉米粉900g,加入6L去离子水调成浆乳，调节pH为5.5-6.0，加入发酵罐，按20U/g 原料加入α-淀粉酶及1g/LCaCl2，搅拌均匀，恒温保持30-60min，液化20min后用0.1%碘液检测不显蓝色或极微淡蓝色为止。

再加入0.5%的硫酸铵。

蒸汽实罐灭菌后，火焰法接种，200r/min,35℃下通空气发酵，罐压控制在表压0.1MPa。

通风量控制0-18h:200-400L/h，18h 以后：600-800L/h。

接种后半小时测总糖一次（取发酵液5mL），并记录PH和通风量。

以后每4小时记录PH和通风量，每八小时测残糖和酸度一次（取发酵液10mL，离心取上清），最后一个班次每2小时测1次。

3.5 分析方法
3.5.1 残糖测定[18]
菲林热滴定定糖法（空白滴定+样品溶液预滴定+样品溶液正式滴定）。

3.5.2总糖测定
取5ml发酵液，加50ml水和7.5ml浓硫酸，加热至沸，保持5min，急速冷却。

冷后用40% NaOH溶液中和至PH7-8，定容至500ml，取样后以残糖测定方法进行测量。

3.5.3 酸度测定[20]
取5ml发酵液，离心取上清液，精确吸取4ml，加入100ml锥形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429 mol／L（5.75g NaOH溶于煮沸过的冷蒸馏水中，定容到1000ml，混匀后标定）进行滴定，滴定至微红色，平行滴定3次，记录平均消耗NaOH的体积。

滴定1ml 样品液，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH时的溶液为1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）。

3.5.4 PH测定
精确PH试纸、PH计（台式）、发酵罐PH电极。

3.5.5 菌种质量检查
(黑曲霉菌)在发酵液成球形体，散开的菌丝较少，菌细胞短，一头较粗如“鞋底状”，而污染的菌多呈菌丝状生长，一般曲霉菌细胞较长而平滑。

取培养液稀释在显微镜下观察，合格的菌丝球应是致密形的，菌球直径不应超过0．1ram，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀[28]。

3.5.6菌浓度测定
采用B种血球计数板，计数室体积为0.1mm3.一个计数室为一个大方格，一个大方格分成25个中格，每个中格又分为16个小格，即一个计数室由400个小方格组成。

计数时，分别在左上、左下、右上、右下和正中五个中格进行计数，然后计算80个小格中平均每小格上菌细胞数，再计算400个小格即整个计数室中的菌体细胞数。

位于中格线上的菌体只记此中格的上方及右方线上的细胞；凡菌体母细胞分裂的子细胞达母细胞大小的一半时，即可作为两个细胞计。

计算公式：每毫升发酵液中黑曲霉菌细胞数=（80小格内细胞数/80）*400*104*稀释倍数。

将样品稀释50倍后，采用上述方法进行计数，每个样品重复计数3次，取平均值[29]。

3.5.7 氧浓度测定
通风量的控制及发酵罐氧分压电极测定。

4. 实验结果与讨论
4.1 实罐发酵与摇瓶发酵的比较
4.1.1 实验数据处理及分析
分别配制8份摇瓶发酵培养基和1份实罐发酵培养基，同时进行发酵，在菌浓度、糖含量、起始PH基本一致的情况下，分别对二者的残糖、酸度、PH、菌浓度、温度进行检测。

实验中在发酵进行大概10h,20h,30h,40h,50h,60h,70h后分别取一份摇瓶发酵液与实罐发酵液，测定其酸度、PH值、菌浓度等参数，并记录发酵温度如下：
表4-1：实罐发酵与摇瓶发酵的对比
35h 17.47 16.25 10.4 10.3 1．95 1.37 52.320.535.4 35.2 45h 16.42 15.48 10.7 11.7 1.74 1.33 34.19.534.9 35.2 59h 15.70 14.37 11.0 11.8 1.55 1.27 20.5 6.835.4 35.2 69h 14.54 15.57 12.0 11.5 1.42 1.36 9.1 4.835.2 35.2 90h / / 12.1 11.3 1.16 1.40 / / / / 依据上述数据绘制摇瓶与实罐发酵过程中残糖、酸度、PH、菌浓度、温度的变化曲线如下：
图4-1：实罐发酵与摇瓶发酵残糖对比
由表格和二者残糖变化曲线可以看出，随着时间的推移，残糖量均呈现下降的趋势，在最开始残糖基本相当的基础上，摇瓶下降的较快，分析原因可能为摇瓶体积较小，温度较为恒定，黑曲霉的适应期相对较短，比较快速的进入了对数增长和稳定期，对数期残糖下降较快，稳定期较为稳定。

而且摇瓶中没有发酵罐的剪切力，有利于黑曲霉的生长。

在生长后期，可能因为染菌和残糖含量不足，黑曲霉开始分解产物柠檬酸，至于最后残糖趋于平稳，甚至有升高的状态。

图4-2：实罐发酵与摇瓶发酵酸度%对比
图4-3：实罐发酵与摇瓶发酵PH对比
酸度与PH值基本上是相互对应的，他们有如下关系：酸度AG=14-2×PH （AG单位为%），因此两者呈现倒置的现象。

从上两图我们可以看出，测量数据基本正确，但在0h时，酸度与PH值偏差较大，很大部分原因是由于此时酸度较小，测量误差大，而且对于接近中性的PH，也会出现较大误差。

从图形中可以看出，随着时间的推移，PH先是迅速下降，说明菌已经开始产酸，在21h 左右时，出现了转折点，此转折点的意义可能在于本阶段已经要从对数期进入稳定期了，摇瓶的酸度下降较快，与第一图的分析对应，实罐发酵酸度一直下降，说明实罐发酵的优势所在，例如原料的供给，氧分的合理分配，还有染菌的可能性较摇瓶小。

其实，实际的发酵应当在PH下降到1.5以下时加入少量的CaCO3以中和酸，保证黑曲霉的生长环境，但为了探讨二者的优势与劣势，没有进行此操作。

图4-4：实罐发酵与摇瓶发酵菌浓度对比
实罐发酵与摇瓶发酵最大的区别应该在于菌浓度的变化，菌的多少在一定程度上决定着产酸的多少，也可以看出其他数据是否存在较为明显误差的一个良好的衡量标准，此处对菌浓度变化做一较为详细的讨论。

在图4-5中，对于菌体浓度从温度一方面做了阐述；
由于在发酵阶段中，摇瓶发酵由于在前期PH下降较为厉害，在一定程度上不利于黑曲霉的生长，故可能导致菌浓度发生一些相对于的改变。

在实罐发酵中，虽然有搅拌作用，但由于黑曲霉是好氧菌，无菌空气从底部加入，而且底部搅拌作用稍微小，故底部的菌浓度可能较高，在测量时会出现偏差较大的现象。

我们认为菌浓度变化曲线规律重点在于实罐发酵与药品发酵的环境不同，实罐发酵有一个较大的空间，在增长后能改变环境，适于它们的生长，而且，摇瓶发酵无法检测实施情况，不能对其进行一些补救操作，使得环境恶化，氧含量减少等，这些原因致使出现了如图的形状。

菌体浓度呈现钟罩型也比较符合实际情况，适应期增长和衰亡期的减少，都在图像上有所体现，在35h时，菌浓度基本最高，说明该时期是出于稳定期，对应的产酸量图也比较平稳，在1.5之下。

图4-5：实罐发酵与摇瓶发酵菌温度对比
温度的变化主要起决于恒温作用的好坏，由图形可以看出，记录的实罐发酵温度有一些细微的波动（基本保持在2℃之间），而摇瓶发酵由于在恒温箱里，温度已经设定，基本不变，故恒定。

温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响从参考资料中查到：恒温发酵在8h-104h为主要产酸期，而且在10h时产酸量最大，变温发酵可以刺激菌体的生长，产酸时间随着时间的增加而增加，与恒温发酵想比，变温发酵最终菌体的量要高。

由图4-3可以看出，在10h之后的一小段时间，实罐发酵PH比摇瓶发酵PH低，也就是可以用上述理论做一解释，在后期，由于变温发酵的菌体多，那么最终产酸量实罐会较多，而且从菌浓度图像也可以看出，在一定程度上验证了此理论的正确性，虽然处在不同的环境，但这些因素会对其产生影响。

4.1.2 综述
从上述五图中可以看出，实罐发酵与摇瓶发酵过程中，残糖、酸度、PH变化规律是基本一致的，菌浓度的趋势也基本一样，温度的变化是外界因素引起，会对内部产生一系列影响，在一定程度上，摇瓶发酵可以代替实罐发酵。

4.2 硫酸铵浓度对黑曲霉摇瓶/实罐发酵生产柠檬酸的影响
在众多的影响因素中，我们发现，存在一些不确定因素的主要有发酵时间、转速、氧含量和含氮酸浓度，硫酸铵类提供了黑曲霉生长所必须的氮源，可以提供氮源的物质中属有机酸对其最有利，如尿素等，本实验限于时间的原因，只对硫酸铵这一影响因子做了一些探讨。

4.2.1摇瓶发酵探究硫酸铵浓度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响
设计摇瓶硫酸铵浓度梯度如下：
表4-2：探究不同硫酸铵浓度对摇瓶发酵生产柠檬酸的影响
摇瓶编号1号2号3号4号5号6号
硫酸铵浓度0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% 如前所述种子培养后，按上表配制不同硫酸铵浓度梯度的发酵瓶培养基，接入相同的接种量，进行摇瓶发酵。

观察记录发酵情况，72h后，发酵结束，测定各发酵瓶中发酵液PH 值、酸度，结果如下：
表4-3：不同硫酸铵浓度摇瓶发酵下72h后的PH、酸度变化
硫酸铵浓度0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% PH 1.40 1.23 1.16 1.11 1.24 1.46 酸度（%）11.311.611.711.811.311.1
将上述表格做图形如下：
图4-6：不同硫酸铵浓度对摇瓶发酵柠檬酸的影响（PH）
图4-7：不同硫酸铵浓度对摇瓶发酵柠檬酸的影响（酸度%）
由图像得知，摇瓶发酵时，随着硫酸铵浓度的提高，黑曲霉产酸率越来越高，浓度超过0.4%之后，产酸开始下降，因此，0.4%左右是摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度。

4.2.2实罐发酵探究硫酸铵浓度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响
实罐发酵时在摇瓶发酵的基础上提出来的，故设计的宽度较窄。

设计实罐硫酸铵浓度梯度如下：
表4-4：探究不同硫酸铵浓度对实罐发酵生产柠檬酸的影响
实罐编号1号2号3号4号5号
硫酸铵浓度0.4% 0.45% 0.5% 0.55% 0.6%
如前所述种子培养后，除发酵条件中硫酸铵按上表设计梯度进行控制外，其他条件与前述发酵培养相同，接入相同的种子量，进行实罐发酵。

观察记录发酵情况，并于72h后进行酸度滴定，结果如下：
表4-5：不同硫酸铵浓度下实罐发酵下72h的PH、酸度变化
硫酸铵浓度0.4% 0.45% 0.5% 0.55% 0.6%
酸度（%）
11.91212.111.7泡沫过多，阻塞管道被迫中止发酵
将上述表格做图形如下
图4-8：不同硫酸铵浓度对实罐发酵柠檬酸的影响（酸度%）
随着硫酸铵浓度的增加，产酸率越来越高，但是当硫酸铵浓度过高时（0.6%），由于产生过多泡沫，至阻塞管道而无法正常进行发酵（后续找了一些消泡剂，但作用不太明显）。

因此，我们认为，硫酸铵浓度在0.5%时对实罐发酵是一个比较理想的条件。

图4-9：不同硫酸铵浓度对摇瓶/实罐发酵柠檬酸的影响对比（酸度）由图4-9可以看出，在一定程度上，实罐发酵比摇瓶发酵的产酸量更大，这一点与前面的结论可以证明，在发酵完成时，实罐的变温发酵在各种有利条件下大于摇瓶发酵。

4.3 实验结论
4.3.1实罐发酵与摇瓶发酵的对比
实罐发酵与摇瓶发酵历程中，残糖和菌浓度的变化规律是高度一致的，PH值的变化规律基本一致，而酸度变化规律却相差很大，分析其原因可能是摇瓶发酵对温度控制比较容易，温度平稳，而实罐发酵温度存在一定变化。

另外，实罐发酵历程中，PH值下降明显比摇瓶快，菌浓度明显高于摇瓶，产酸也明显高于摇瓶发酵，分析其原因可能是实罐发酵通入无菌空气，相比于摇瓶发酵氧气充足。

因此，摇瓶发酵与实罐发酵存在一定不可忽视的差异，虽然摇瓶发酵历程与实罐发酵历程中各主要参数变化规律基本一致，而且利用摇瓶发酵探究黑曲霉发酵生产柠檬酸工艺的优化在保证接种量相同与恒定发酵温度时比较有利，但是其在溶氧量及产酸方面与实罐发酵有实质性的区别，在研究过程中应在理论研究之后，进行工业放大，即实罐发酵，进行进一步的验证，并修订实验结果，才能对工业生产有实质性的指导价值。

4.3.2摇瓶发酵与实罐发酵的最佳硫酸铵浓度
摇瓶发酵时，随着硫酸铵浓度的提高，黑曲霉产酸率越来越高，但是超过0.4%之后，产酸又开始下降，因此，0.4%是摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度。

与其他探究结果一致（黑曲霉发酵生产柠檬酸的最适硫酸铵浓度为0.4%[30]）。

工业放大，实罐发酵进一步验证和修正后发现，随着硫酸铵浓度的增加，产酸率越来越高，但是当硫酸铵浓度过高时，产生泡沫过多，将阻塞管道而不能正常进行发酵。

因此，硫酸铵浓度为0.5%是比较理想的发酵条件。

参考文献
[1] 生物工程专业实训讲义，上海交通大学生命科学技术学院
[2] 全国科学技术名词审定委员会百度百科科技名词定义“柠檬酸”/view/122100.htm
[3] 胡雅琴，培养基组成对纤维素糖化液发酵生产柠檬酸的影响，山西化工，2003，第23卷第4期，20-21.
[4] 全国科学技术名词审定委员会百度百科科技名词定义“三羧酸循环”。