3-POD同工酶的提取及电泳检测

实验三 POD同工酶的提取及电泳检测

摘要：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，进行了POD同工酶的提取及检测实验。为蛋白质的分离、鉴定提供科学依据。

关键词：POD同工酶，聚丙烯酰胺凝胶电泳

引言：

过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。

1 材料

1.1 材料：小麦、玉米幼苗

1.2 仪器：（1）分光光度计；（2）移液管（3）离心机（4 000r/min）；（4）研钵(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (6)稳流稳压电泳仪；（7）高速冷冻离心机；（8）电子天平；（9）电冰箱；（10）瓷盘、微量进样器；（11）电热恒温水浴锅；（12） S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等

1.3 试剂：

（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制；（2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）；

（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅰ）；

（5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液Ⅱ）：（6）过硫酸铵溶液（NH4）2S2O8简写Ap：（当天配制）；（7）核黄素溶液；（8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）；（9）40%蔗糖；（10）pH4.7乙酸缓冲液；（11）样品提取液；（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g 溶于100ml无离子水；（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加160ml水加Vc140.8mg加几滴30%过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套；（14）0.05M pH5.5磷酸缓冲溶液；（15）0.05M 愈创木酚；（16）2%H2O2；

2 实验方法

2.1.贮液的配制：

2.2凝胶的制备：

胶灌至距梳子齿下端1cm →灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

聚合好。

2.3酶液的制备：称取大麦幼苗茎部1g →加样品提取液1ml →于冰浴中研成匀浆→然后以2ml提取液分几次洗入离心管→在高速离心机上以4000转/每分钟，离心10min →倒出上清液，以等量40%蔗糖混合→低温放置待用。

2.4装槽：取出胶板下端胶条→用滤纸擦净凡士林油→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲液。

2.5电泳：接通电源→稳流→调节电流到每孔1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，停止电泳。

2.6剥胶、固定、染色：将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯胺），显色→观察记录。