免疫胶体金技术及其应用

第26卷第3期 河 南 林 业 科 技 Vol. 26 No. 3 2 0 0 6年9月 Journal of Henan Forestry Science and Technology Sep. 2 0 0 6
收稿日期：2006-07-20
作者简介：曾辉（1982-），男，信阳人，在读硕士研究生.
免疫胶体金技术及其应用
曾辉 1，翟晓巧2，刘艳萍1，张国俊3，李晓梦
4
（1.河南农业大学，郑州 450002；2. 河南省林业科学研究院；
3.禹州市林业技术推广中心；
4.镇平县林业局）
摘 要：免疫胶体金技术是继三大标记技术后对免疫标记技术的又一大贡献，近年来发展迅速，应用范围极广。

综述了免疫胶体金技术的原理、特点和应用，并分析了存在的问题，针对其存在问题提出展望。

关键词：免疫胶体金技术；应用
中图分类号：S482.8 文献标识码：B 文章编号： 1003-2630（2006）03-0037-02
Immune colloidal gold technique and its application
ZENG Hui ,ZHAI Xiao-qiao ,LIU Yan-ping
（1. Henan Agriculture University,Zheng zhou 450002,China
2.Henan Forestry Research Institute, Zhengzhou 450008,China)
Abstract: Immune colloidal gold technique has great contribution to immunal labeling technique ,it develops quickly and applies comprehensively in recent years.The paper summaries the principle 、advantage and application of immune colloidal gold technique , meanwhile analyses the problem , then puts forward prospect.
Key words: Immune colloidal gold technique ; application
免疫胶体金技术(ICG)是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。

1962年Feldherr第一次介绍了胶体金可作为一种电子显微镜水平的示踪标记物。

1971年，Faulk 和Taylor [1]首次用免疫金标技术研究沙门氏菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

这一年被公认为免疫胶体金技术诞生年。

近年来，研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。

1免疫胶体金技术的基本原理
氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小
的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。

由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。

这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

2免疫胶体金技术的特点
免疫胶体金技术是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，与现有其它标记方法和标记物相比，有以下特点：（1）胶体金制备容易，价格低廉；（2）免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，几乎不出现非特异性吸附；（3）金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体，实现在同一张切片上观察
两种以上的抗原，也可以和其他标记物配合进行双重或多重标记；（4）既可用于光镜，又可用于电镜；既可用于透射电镜，又可用于扫描电镜；（5）可以标记多种生物大分子物质，如抗体葡萄球菌蛋白A（SPA）、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白质而不影响其生物活性；（6）由于胶体金本身有鲜艳的橘红色，可用光镜或肉眼观察实验结果，也可用分光光度计测定光吸收，进行定量分析。

可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来半定量抗原；（7）灵敏度高，染色简便，不影响原有超微结构的观察，显色结果可长期保存等。

3免疫胶体金技术的应用
胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，所以它的应用范围极广。

3.1在免疫学检验中的应用
Leuvering [2]于1980年最早报道了用胶体金检测人绒毛膜促性腺激素(hCG)的凝集试验，1985年起有商品试剂盒供应，从此胶体金成为免疫学测定方法研究开发的新热点，新的方法和试剂盒层出不穷。

3.1.1 凝集试验 单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。

3.1.2 蛋白质印迹技术 除用胶体金结合物替代传统蛋白印迹法中的酶或放射性同位素等作标记物外，其原理和操作基本同传统法，但有以下优点：（1） 信号本底比大；(2) 无处理放射性同位素的麻烦；(3) 结果可长期保存；(4) 可采用银放大技术，灵敏度至少可提高10倍。

3.2应用于流式细胞仪中
应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞
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表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。

但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。

这样可以同时进行几种标记。

该标记物必须能够改变散射角，而胶体金可以明显地改变红激光散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。

3.3在快速诊断技术中的应用
3.3.1在斑点免疫渗滤实验中的应用斑点免疫渗滤试验又名滴金免疫测定法(简称滴金法)。

是20世纪80年代末发展起来的一种快速免疫学测定方法，其基本原理是:以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置迅速完成(反应时间可缩短为数分钟)。

其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与己结合在膜上的抗原相结合。

因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点，阴性反应则不会出现这种红色斑点。

Moeremans等用此法研究表明免疫胶体金斑点渗滤法比间接过氧化物酶法更敏感一些。

国外研制出的用胶体金A蛋白作为标记物检测抗爱滋病病毒抗体的试剂可在 5min内在NC膜上观察到清晰的红色斑点。

裘丽珠等（1992）、徐梅倩等（1996）、钱应娟等 （1999）、王春仁等（2000）、于庭等（2000）、王虹玲等（2001）应用胶体金标记SPA，建立了检测日本血吸虫、边虫病、猪旋毛虫病、羊东毕吸虫病、囊虫病、抗精子抗体的DIGFA，该法敏感性和特异性与ELISA法具有良好的相符性，且具有反应快、操作简便、结果易于观察等优点，标记好的诊断试剂盒可以长期保存，随时使用，更适合于基层推广应用。

3.3.2在免疫层析实验中的应用 免疫层析试验，是以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。

在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应并通过免疫金的颜色显示出来。

周继文等（1998）建立了用胶体金标记乙肝表面抗体制成免疫层析试纸条检测血液中的乙肝表面抗原，灵敏度可达1ng/ml，与酶免疫法比较，两法符合率为 99%。

吴英松等（2002）利用胶体金标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，检测重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶最低检测量为1ng。

3.4在生物传感器上的应用
近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多， Kim J H等[3]通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集。

从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法，并且通过在胶体金上包被导电聚合物聚苯，提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。

2003年Brainina K等[4]在标记胶体金标记A蛋白的基础上。

制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器。

检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度。

Mena ML[5]应用胶体金催化性质的修饰酶生物传感器的电极表面。

Tang D等[6]基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体敏感性和稳定性。

Kitano H等[7]用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。

3.5在植物保护研究上的应用
3.5.1 植物病害超微病理的研究利用免疫电镜技术研究植物病害的超微病理，其原理是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析。

特异性抗体用铁蛋白、胶体金或过氧化物酶标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物的所在位置，即为抗原抗体的反应部位。

2002年，李红叶等[8]利用免疫胶体金标记技术检测寄主体内的葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus GFLV)移动蛋白，进一步证实了GFLV是通过管状结构实现细胞间移动的。

彭日荷等[10]同样利用此技术研究了甜菜多粘菌传带甜菜坏死黄脉病毒的部位。

刘云霞等[9]运用电镜免疫胶体金技术研究了水稻内生细菌。

3.5.2 转基因植物产品的检测 以转基因植物中外源目标基因表达的产物为抗原，制备其特异性抗体，用胶体金标记抗体，制作免疫层析试纸条或斑点渗滤试剂盒，可快速、灵敏地检测转基因植物产品，并可通过定量或半定量技术初步鉴定其质量。

4存在问题及展望
因免疫胶体金技术是以金颗粒作为特异细胞成分的标记物，金颗粒本身的性质决定了该技术存在着一些问题：（1）胶体金颗粒大，渗透能力相对较差；（2）在操作过程中要求清洁程度高；（3）胶体溶液的稳定性较差，因此，胶体金溶液存放时间相对较短，保存时间半年到一年。

这些问题导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。

为扩大免疫胶体金技术的应用范围，在解决这些问题的基础上应做到两点：（1）进一步提高检测灵敏度，灵敏度的提高无疑会拓宽金免疫结合试验的检测范围，而采用信号放大系统如生物素亲和素系统或免疫金银染色法进行银加强，并结合一些相应的简单检测仪器可能是最有希望的途径之一。

（2）实现检测多元化，可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定两种方式。

一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质有很大的应用价值，如对献血者检查HBsAg、艾滋病病毒抗体和抗原以及抗HCV。

另外对在围产期检查抗弓形体、抗巨细胞病毒和抗风疹病毒等的抗体也极为有用。

总之，免疫胶体金技术是继三大标记技术之后，又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。

在今后的研究中，免疫胶体金技术将更进一步显示其巨大的优越性，同时也将在更广阔的领域内发挥其作用。

参考文献：
[1] Faulk W,Taylorn G M. An immunocolloidal gold method for the
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（责任编辑：王团荣）。