凝胶过滤层析
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
第2章 凝胶过滤层析
五、【实验器材】
层析柱 恒流泵
紫外检测仪
部分收集器
试管等普通玻璃器皿
六、【操作方法】
凝胶的处理 装柱；平衡； 上样； 洗脱和检测； 层析柱的再平衡；
1、凝胶的处理
Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分 溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温 后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
使用方法
1. 检查：连接是否正确，将“波长”旋钮旋到所需波长刻度； 2. 预热：按下 “电源”开关，电源指示灯亮； 3. 调100%：把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量” 旋钮，数字显示为100，即透光率为100％； 4. 调零：把“灵敏度” 旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调 节“调零”旋钮，数字显示为“0”。 备注：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调 节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变 “灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。
1与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关2与柱的长短粗细无关每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数特定的分配系数kdkdvevokdvivevokdvi2vevikd分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1最后流出
一、一般介绍
280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系 统，绘制洗脱曲线。
6、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍 床体积）即可。
7、凝胶的再生及保存
再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以
恢复其性能
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠
或0.002%双氯苯双胍己烷
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析
持柱床面平整；
洗脱时流速不可太快或太慢；
透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋
胀破。
生物化学与分子生物学教研室
六、实验结果
磷酸盐的鉴定
试剂量
透析前杯内 蒸馏水 透析后杯内 蒸馏水
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸试剂
反应结果
15滴 10滴
2滴 2滴
3滴 3滴
无 蓝色
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蛋白质的鉴定
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实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与 高铁氰化钾及透析技术
生物化学与分子生物学教研室
一、实验目的
掌握凝胶层析的原理
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝 胶层析技术 了解凝胶层析的应用
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二、实验原理
凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离，也称分子筛层析、排阻层析。
层析管洗净、排出管中气泡
关闭出口
固定在铁架上 加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm左右 不可露出床面 盖滤纸
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装柱要求:
连续
均匀 无气泡
无分层
床面平整
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3. 平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开出 口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平 衡(5-10min )，不可露出床面，关闭 出口
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蛋白质的鉴定
试液量 透析前杯内蒸 馏水 透析后杯内蒸 馏水 透析袋内溶液 15%三氯醋酸 反应结果
40滴 40滴 10滴
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
4.1 凝胶过滤层析
㈡ Superdex
是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤 介质,是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之 一。Superdex是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖 颗粒共价结合而形成的，属于复合型凝胶 。
在该凝胶的结构中，琼脂糖基质决定了凝胶 具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝 胶的层析特性。
三、Gel过滤色谱中溶质运动的特征
㈠. 洗脱体积Ve Ve 与样品体积 VS 有关
具体影响如下图说明：
(二）. 分配系数Kd
Kd =
固定相中溶质浓度（g/l） 流动相中溶质浓度（g/l）
A类分子 Kd=0 Ve = V0 C类分子 Kd=1 Ve = Vi + V0 B类分子 0〈 Kd〈 1
• 2.脱盐
第一节 凝胶过滤色谱基本理论
一、
简单原理
凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同 的分子流动产生不同的阻滞作用。
孔隙
间隙
颗粒粒径几十到几百um
间隙几到几十um
孔隙的孔径nm级
（一般大分子也在nm级）
要分离的分子分为三类：
A类：dA＞最大孔径，全排阻（出） 凝胶对它无阻滞，最早流出；
C类：dC＜最小孔径，能进入全部孔隙区 阻滞最大，流速最慢，最晚流出；
二、 实验设计要点 ㈠. 要求
⒈高分辨率 Rs = 2Y/(W1+W2)
Y
W1
W2
Rs应〉1.2 （减小W，增大Y）
⒉回收率高（减少峰宽，可提高回收率）
⒊减少稀释（避免以下几种情况） ⑴. 涡流扩散 （通道不均匀） ⑵. 动定相不平衡（速度过快） ⑶. 纵向分子扩散 （速度过慢）
⒋短时间 尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离
A类与B类、B类与C类、A类与C类间 ⒉分级分离
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析是用一定大小的凝胶柱作为分离介质，在固定相（吸附剂）和流动相之间加入适当的溶液，使两种组分通过柱时发生不同的作用而分离开来的一种分离方法。
凝胶是一种高分子聚合物，它具有多孔结构，大分子间可相互接触并可相互渗透，由于大分子间有氢键和离子键等相互作用，因此它们在溶液中很容易扩散。
大分子在流动相中是分散的，因此在流动相中它们很容易受到洗脱。
凝胶层析利用凝胶中所含的高分子聚合物（如蛋白质、多糖等）能吸附溶质分子而使其不能通过而在另一种溶液中析出的特性进行分离。
凝胶过滤层析是分离技术中最复杂、最难的方法之一，也是研究得最多、应用最广的方法之一。
蛋白质、多糖等大分子物质在流动相（如NaOH）中不能快
速通过大分子间的作用力而被吸附在柱上。
但当蛋白或多糖等大分子物质达到一定浓度时，大分子间的作用力就会减弱或消失，这时它就会通过柱，但这时由于上柱过程中水和溶质不能完全洗脱，所以就会有部分蛋白质或多糖留在柱上。
—— 1 —1 —。
凝胶过滤层析的原理及应用
凝胶过滤层析的原理及应用1. 引言凝胶过滤层析是一种常用的生物化学实验技术，它基于凝胶质地的特性，在生物分子的分离和纯化过程中发挥重要作用。
本文将介绍凝胶过滤层析的原理以及其在实际应用中的一些例子。
2. 原理凝胶过滤层析的原理是基于分子在凝胶质地中的大小排列和相互作用的差异。
凝胶是一种具有多孔结构的材料，其孔径可以通过调整凝胶成分和交联程度来控制。
较大的分子无法穿过较小的孔径，因此会在凝胶质地中滞留，而较小的分子则可以自由通过凝胶。
3. 凝胶的种类凝胶过滤层析常用的凝胶包括聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）等。
聚丙烯酰胺凝胶适用于分离小分子量的蛋白质和核酸，而琼脂糖凝胶则适用于大分子量的生物大分子的纯化和分离。
4. 凝胶过滤层析的步骤凝胶过滤层析主要包括样品预处理、样品加载、层析和洗脱等步骤。
4.1 样品预处理样品预处理是为了使样品适应凝胶过滤层析的条件。
常见的样品预处理包括酸碱调节、盐浓度调整和添加缓冲剂等。
4.2 样品加载样品加载是将预处理好的样品加入凝胶中。
通常可以通过吸引力（如电泳力）或压力驱动来实现样品的加载。
4.3 层析层析是指将样品在凝胶质地中进行分离的过程，其中较大分子滞留在凝胶中，而较小分子则通过凝胶自由扩散。
层析时间可以根据实验需要进行调节。
4.4 洗脱洗脱是将目标分子从凝胶中提取出来的过程。
常见的洗脱方法包括添加高浓度盐溶液和改变pH值等。
5. 应用凝胶过滤层析在生物化学实验中有广泛的应用，以下是一些常见的应用例子：5.1 蛋白质纯化通过调整凝胶孔径和交联程度，可以将不同分子量的蛋白质分离和纯化。
凝胶过滤层析在蛋白质纯化中起到了关键的作用，可以实现高效高纯度的蛋白质纯化。
5.2 DNA片段分离凝胶过滤层析也可以用于DNA片段的分离，常见的应用包括PCR产物纯化、DNA限制性酶切产物分离等。
通过选择适当的琼脂糖凝胶孔径，可以将目标DNA片段从其他杂质DNA中分离出来。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术（GFC，Gel filtration chromatography）是一种基于分子大小差异的分离技术。
该技术通过在一个多孔凝胶柱中进行分离，使分子根据其大小在凝胶柱中的迁移速率不同而得到分离。
本文将详细讲解凝胶过滤层析技术的原理。
凝胶过滤层析技术的原理基于分子在多孔凝胶柱中迁移的速率与其体积大小成反比的规律。
凝胶柱中的多孔凝胶由多聚物（如聚丙烯酰胺、海藻酸钠等）构成，呈现出一定的孔径分布。
分子小于凝胶孔径的分子可以进入孔道中，而大于凝胶孔径的分子则无法进入孔道，只能沿凝胶颗粒表面通过。
因此，相对较大的分子在凝胶柱中的迁移速率更快，相对较小的分子则迁移速率较慢。
具体而言，凝胶过滤层析技术分为两个主要步骤：样品加载和洗脱。
1.样品加载：首先将待分离的样品溶液加入到凝胶柱中，样品中的各种分子根据其体积大小进入到凝胶孔道或沿凝胶颗粒表面通过。
体积较大的分子无法进入孔道，因此会快速通过凝胶柱，迁移速率较快。
体积较小的分子则能够进入孔道，受到凝胶孔道的阻碍，迁移速率较慢。
这样，样品中的不同分子就会在凝胶柱中根据其体积大小而分离。
2.洗脱：在样品加载后，需要通过洗脱来收集分离的目标分子。
洗脱过程中使用一种洗脱缓冲液，缓冲液的成分和pH值可以调整以满足对目标分子的选择性洗脱。
这样，在洗脱过程中，不同体积大小的分子将以不同的速率从凝胶柱中洗出，实现对目标分子的分离纯化。
需要注意的是，凝胶过滤层析技术不仅仅能够根据分子的大小分离，还可以用于蛋白质的分离，通过调整凝胶柱中的凝胶孔径和选择合适的缓冲液来实现蛋白质的选择性分离。
总结而言，凝胶过滤层析技术通过利用多孔凝胶柱的孔径分布特性，实现对分子根据其体积大小的分离。
通过加载样品并使用合适的洗脱缓冲液，不同体积大小的分子可以在凝胶柱中分离纯化。
这种技术简单易行，广泛应用于分子生物学、生物医学等领域的分离纯化研究中。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
粒好象一个筛子，每个凝胶颗
大分子物质被排阻在外。
03
又名分子筛过滤，排阻层析
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
平面层析法
层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
适用： 杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
3.凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography）
离子交换层析法
固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离
亲和层析法
固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离
凝胶层析法
固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
按层析原理分类
按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200
多孔网孔结构
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
（3）凝胶的选择
例：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
Sephadex G-50：
C. 聚丙烯酰胺凝胶 商品名: Bio – gel – P（生物胶P）
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。
该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。
凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。
离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。
凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。
通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。
凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告一、引言凝胶过滤层析是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于生物医学研究、生物制药等领域。
本实验旨在通过对凝胶过滤层析的研究，探讨其原理、方法和应用。
二、凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子的大小和形状选择性地分离混合物中的组分。
凝胶材料通常是多孔的，具有不同大小的孔隙，通过调整凝胶材料的孔隙大小，可以选择性地分离分子。
三、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶材料装入柱中，并将柱与收集容器连接。
2. 样品处理：将待分离的混合物样品处理，去除杂质和大分子。
3. 样品加载：将处理后的样品加载到凝胶柱上。
4. 洗脱：用缓冲液洗脱凝胶柱上的目标分子。
5. 收集：将洗脱液收集于容器中，得到纯化后的目标分子。
四、实验结果与讨论本实验使用了凝胶过滤层析技术对蛋白质混合物进行分离和纯化。
实验结果显示，凝胶过滤层析能够有效地分离目标蛋白质，并具有较高的纯度。
在实验过程中，我们发现凝胶材料的孔隙大小对分离效果有重要影响。
较大的孔隙可以让较大分子通过，而较小的孔隙则只允许较小分子通过。
因此，在选择凝胶材料时，需要根据目标分子的大小来选择合适的凝胶。
此外，凝胶过滤层析还可以用于去除杂质和浓缩目标分子。
在洗脱过程中，通过调整洗脱缓冲液的成分和pH值，可以更好地控制目标分子的洗脱效果。
凝胶过滤层析技术的应用非常广泛。
在生物医学研究中，它常用于蛋白质纯化和分析，可以帮助研究人员获取纯度较高的蛋白质样品，从而进行后续的功能研究。
在生物制药领域，凝胶过滤层析可以用于制备药物和疫苗，提高产品纯度和质量。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
例如，对于较大的分子，凝胶材料的孔隙可能不够大，导致无法通过。
此外，凝胶过滤层析的操作相对较慢，需要较长的时间来完成分离和纯化过程。
综上所述，凝胶过滤层析是一种有效的生物分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。
通过对凝胶过滤层析的实验研究，我们深入了解了其原理、方法和应用，并对其优缺点有了更清晰的认识。
第三章 凝胶过滤层析
交联度
交联剂占单体和交联体总量的百分数 凝胶颗粒孔径大小与交联度有关
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）
其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质 完全渗入凝胶内。
分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地 深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最 后得到分离。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。
柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ
计算法： Vt = 1/4 D2h
测量法： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 由于Ｖｇ 非常小，可忽略不计，因此： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ Ｖ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝 色葡聚糖-2000； Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
（2）样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。
影响流速的因素
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
凝胶过滤层析
【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。
本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。
（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。
（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。
（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。
多洗几次，尽量洗干净。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
充分溶胀后，进行真空脱气。
（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。
（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。
（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
（8）上样：上样量在5%~10%。
（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。
三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤：
①选取合适粒径交联度的凝胶介质如Sephadex G-25根据分子量范围决定；
②准备柱子前需用大量蒸馏水浸泡凝胶颗粒直至完全膨胀恢复活性；
②装柱时缓缓倾倒凝胶悬浮液沿柱壁旋转使之内层密实无明显气泡夹杂；
④平衡过程中用磷酸盐缓冲液PBS以恒定流速洗涤直至流出液pH值稳定；
⑤样品制备时需离心去除沉淀溶解于少量缓冲液中保证浓度适中；
⑥上样后立即开启蠕动泵控制流速让样品均匀分布避免形成沟道效应；
⑦收集各个分数时预先准备好试管架编号记录每管对应体积位置；
⑧检测分子量分布可通过紫外检测器或其他合适手段监测洗脱峰；
⑨对于感兴趣峰段合并浓缩后可通过SDS-PAGE电泳进一步验证纯度；
⑩实验结束后拆卸清洗层析柱防止残留物质影响下次使用效果；
⑪根据实验目的选择合适分子筛范围重复上述过程直至达到分离目标；
⑫数据分析时注意计算保留时间体积并与标准曲线对比确定各组分分子量。
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带教:
实验报告的书写
一、实验目的 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白质
一、实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
二、实验原理
1. 常用生化分析技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 生物大分子制备技术
2. 凝胶选择、制备 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500） （11400） 选择 Sephadex G-50 Sephadex G-50： 对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
制备：
将干胶颗粒悬浮于5 ~ 10倍的蒸馏水或洗脱液中 充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍 数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
例：
Sephadex G-50：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:
1500 – 30000
Sephadex G-200：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:
5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A )
肽键
四、 实验结果与讨论
绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果
下次实验：
《碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定》
时间：4月17日上午8：30开始
层析技术
2. 层析技术（色谱技术）
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
（1）层析系统的基本组成
固定相 + 流动相
固体物质 / 固定于固体物质的成分 可以流动的物质： 如水和各种溶媒
待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、 溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含 量对比）不同 与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快
分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一 组分，从而达到将各组分分离的目的
（2）层析法的分类
按两相所处状态分类
流动相
液体
液体 液—液层析法
气体
气—液层析法
固定相
固体
液— 固层析法
气— 固层析法
按层析原理分类
名称 原理 吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附 剂表面吸附能力不同而分离 分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同 离子交换层 固定相是离子交换剂，各组分与离子交换 析法 剂亲和力不同而分离 亲和层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合， 以此和无亲和力的其它组分分离 凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不 同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同
对实验条件要求高 ( 温度, pH )
＜40℃
4.5- 9.0
工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限, 用于大分子物质的分离
C. 聚丙烯酰胺凝胶
商品名: Bio – gel – P（生物胶P）
三、 实验操作
1. 柱的选择 直径： 1~5 cm 一般长度：直径 = 10：1 ~ 20：1 本实验玻柱： 直径0.8~ 1.5cm 长度 17~ 20cm
按操作形式不同分类
名称 柱层析法 操作形式 固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
（3）层析技术的优点
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度
5. 加样
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露
出床面时，立即关闭出口（将干未干） ② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 ③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
6. 洗脱
① 当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸
3. 凝胶装柱
①柱固定于架子上，垂直放置，关住出口
②自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，
至1 ~2cm时，打开出口
③凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口
注意点： ຫໍສະໝຸດ 直放置 防止气泡产生 防止柱的分层
4. 平衡
放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
馏水，进行洗脱，直到两带分开
② 检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，
用试管分步收集洗脱液 ③ 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d ④ 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）
缩二脲反应 （双缩脲反应）
O
O CuSO4 碱性 紫 红色
H2N - C - NH - C - NH2
（2）凝胶的特点
属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条 件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要 有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。 交联葡聚糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
（3）凝胶的选择
多孔网孔结构 A. 葡聚糖凝胶 (商品名: Sephadex，Dextran) 型号: G-10 – G-200
应用范围广
适用：
杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析
3. 凝胶过滤层析法 （gel filtration chromatography） （1）原理：
根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗 粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部， 大分子物质被排阻在外。
又名分子筛过滤，排阻层析