体内药物分析常用生物样品处理方法与方法学验证资料
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7
测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、 EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血 浆。
8
血浆中含有的物质种类和比例
9
血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
1
1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
2
生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之 外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以 及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形 成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在，需要 分离后测定药物及代谢物。
后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
18
②加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋
白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
19
③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形
11
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
12
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
16
Hale Waihona Puke Baidu
实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
17
优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。 缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理
10
一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
13
生物样品的保存：
采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
14
主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
3
2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强 酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
20
④加入锌盐或铜盐沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
21
④酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
22
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
5
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
6
全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
15
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
丁基甲醚和氯仿等。
应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、 有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+
碱性药物的解离：B + H2O
B+ + OH-
23
2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
24
有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的 溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔
测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、 EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血 浆。
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血浆中含有的物质种类和比例
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血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
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1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
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生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之 外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以 及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形 成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在，需要 分离后测定药物及代谢物。
后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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②加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋
白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
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③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形
11
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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Hale Waihona Puke Baidu
实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。 缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理
10
一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
13
生物样品的保存：
采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
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主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强 酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
20
④加入锌盐或铜盐沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
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④酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
22
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
5
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
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全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
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①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
丁基甲醚和氯仿等。
应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、 有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+
碱性药物的解离：B + H2O
B+ + OH-
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2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
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有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的 溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔