分离分析法导论

分离度基本方程式：
R4nr2,r12, 11k'k '1
n有 效r2,11 4 r2,1
n16R2(r2,r12, 11)2（ k'k' 1） 2
n有效16R2
( r2,1 )2 r2,1 1
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（1）分离度与柱效的关系
R
n 4
r2,r12,1仪1器k分'k'析1
n越大，R越大——n=L/H， (R1/R2)2 = n1/n2 = L1/L2 增加柱长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。
相对保留值（2,1）：也称选择性因子，为两组分的调整保留值之比
,
t V R(2)
2,1
,
t V R(1)
, R(2)
, R(1)
一般选择tR2’大于tR1’，所以值大于1， 越大，分离效果越好。
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仪器分析
色谱峰的个数——判断组分的个数
色谱图 色谱峰的保留值——定性分析 信息 色谱峰的面积或峰高——定量分析
分配比影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质； 温度和压力等因素；流动相及固定相的体积。
k' tR' tR t0
t0
t0
k' VR' VR V0
V0
V0
（组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此分
配比又称分配容量或容量因子）
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二、色谱分析法基本理论
仪器分析
A,B组分未分离
A 1.065hY 0.15Y 0.85 （ 非 对 称 峰 ） 2
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仪器分析 ③保留值：表示试样中各组分在色谱柱内停留状况的指标，反映组分分子与
固定相分子间作用力的大小，通常用时间和流动相的体积表示。
用时间表示的保留值（单位：min，s等）
死时间（t0）：不被固定相保留的组分，从进样到出现最大峰所
解 ：（1）柱的分离度 R = 2（17.63 - 16.40）/（1.11 + 1.21）= 1.06 （2）柱的平均塔板数 n = 16 (16.40 /1.11)2 = 3493 n = 16 (17.63 /1.21)2 = 3397 n平均 = （3493 + 3397）/ 2 = 3445 （3）达到1.5分离度所需的柱长度 R1 / R2 = ( n1 / n2 )1/2 n2 = 3445 (1.5 / 1.06)2 = 6898 L = nH = 6898(300 /3445) = 60 cm
（2）常用术语
仪器分析
①基线：柱中只有流动相流过时，检测器的响应信号记录值， 稳定的直线应是一条水平直线。
②峰高h：色谱峰顶点与基线的垂直距离 峰宽：峰底宽Y 半峰宽：1/2h处的峰宽，Y1/2 标准偏差：0.607h处的峰宽为2 峰面积：
Y4
Y12 2.354
A 1 .0 6 5 h Y 12 (对 称 峰 ）
范氏方程
HABCu u
2dp
2Dg
u
0.01k'2 [(1k')2
d2p Dg
2k' 3(1k')2
d2f ] Ds
总的影响因素：填充物的均匀程度，填充物粒度的大小，流动相的种类 和线速，固定相的液膜厚度
H A B Cu u
BCu2 BCu2 BC
u
u
H最小=A+2 BC
B u最佳 = C
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相对保留值——固定相与流动相的选择是否合适 保留值、区域宽度——评价色谱柱分离效能的好坏
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（3）分配平衡
样品组分在固定相 与流动相之间进行 多次分配使其得到 分离。
仪器分析
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仪器分析
色谱分离原理及分离参数
样品在固定相与流动相之间进行分配，很快达到平衡，即分配平 衡。当流动相流过时，样品将在流动相和新的固定相中又达到分配平 衡，同时原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分 配平衡，随着流动相的不断流过，它们携带发生分配平衡后仍存在于 流动相中的样品沿着柱子向前流动，从而达到不同组分分离的目的。
气相色谱（GC） 气液色谱（固定相为固定液，即固定相是附着在惰性载体上
的一薄层有机化合物液体） 气固色谱（固定相是固体吸附剂）
液相色谱（LC） 液液色谱 液固色谱
（2）按固定相的固定方式分
柱色谱（固定相装于柱内的色谱法） 纸色谱（固定相是滤纸上的水分，呈平板状 ） 薄层色谱（固定相是吸附剂粉末制成的薄层，呈平板状）
B/u-分子扩散项（纵向扩散项）
样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散
仪器分析
B2Dg
（a）柱内组分扩散
n影响因素：
（b）相应的响应信号
：弯曲因子。填充柱中由于固定相颗粒的存在，使分子自由扩散受
到阻碍，扩散程度降低，<1；空心毛细管柱=1。
Dg：组分分子在其气相中的扩散系数。组分分子量大，柱温高， 柱 压大， 载气分子量大， Dg小；反之则大。
u：流动相平均线速，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流 动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。
n结论：
采用分子量较大的载气，较高的载气流速，控制较低的温度，可使 分子扩散项系数减小
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仪器分析 浙江万里学院生物与环境学院
Cū-传质阻力项
物质迁移过程中存在的阻力
CCmCs
Cs：固定相传质阻力项系数，组分分子由流动相进入固定相内部，达到分配
平衡，又回到界面，再溢出界面，被流动相带走这一过程受到的阻力
Cs
2k' 3(1k')2
d2f Ds
n 影响因素：容量因子k’ ，固定液液膜厚度df ， 组分在固定相中的扩散系数Ds n 结论：降低液膜厚度
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仪器分析
一、色谱分析法及其基本概念
1、色谱法的发展
1906年，俄植物学家M.Tswett分离植物色素 植物叶的色素组成
叶绿素a（蓝绿色） 叶绿素b（黄绿色） 胡萝卜素（橙色） 叶黄素（黄色）
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仪器分析
仪器分析 浙江万里学院生物与环境学院
Developing of Chromatographic Technique
A,B组分分离不完全
两组分的分配系数有差异 区域扩散速率小于区域分离速率
受哪些因素影响？
A,B组分分离完全
n 塔板理论 n 速率理论
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1、塔板理论
仪器分析
假设：
（1）色谱由一系列连续的，相等的水平塔板组成，
每一塔板高度为H，理论塔板数n=L/H
（2）在每一塔板内，组分可在两相间迅速达到平衡
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2、速率理论
1956年，荷兰，范弟姆特，速率理论
H A B Cu u
A：涡流扩散项系数，B：分子扩散项系数， C：传质项系数，u：平均流速
A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高 A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低
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仪器分析
A-涡流扩散项
仪器分析
由于流动相流经填充物的不规则空隙时，其流动方向改变，形成 紊乱的类似“涡流”的流动而引起
A2dp
涡流扩散过程示意图
n 影响因素： ：填充不规则因子； dp：填充物平均直径
n 结论 dp越小（采用小颗粒填充物），越小（颗粒均匀），A就越小，空心
毛细管柱A＝0
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仪器分析 浙江万里学院生物与环境学院
改变固定相和流动相的性质、组成或降低柱温，可有效增大r2,1值。
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已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为仪器分析 16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min，计算：（1）柱 的分离度；（2）柱的平均塔板数；（3）达到1.5分离度所 需的柱长度。
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Developing of Chromatographic Technique
仪器分析
1982, less than 30 minutes separation for 18 of amino acids
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仪器分析
2、色谱法分类
（1）按流动相和固定相所处状态分
制备一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。
（2）分离度与分配比的关系
k增大可使R增大，当k >10时，k/k＋1改变不大，R增长是不大， 一般取k为1~10最宜。 改变柱温和相比，可以改变k。
（3）分离度与相对保留值的关系
r2,1= 1时，R = 0，不能使两组分分离。 r2,1>1才可进行分离。 r2,1大，选 择性好。 r2,1的微小变化，就能引起分离度的显著变化。
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分离度
仪器分析
分离度概念：又叫分辨率或分辨度，色谱峰中相邻两峰分离程度的量 度，是相邻两峰保留值之差与两峰峰底宽的平均值之比。
R tR(2) tR(1)
1 2
(Y1
Y2
)
R值越大，表明相邻两组分分离越好 Rs<1，两峰部分重叠 Rs=1，两峰刚好分离(分离程度可达98%) Rs>1.5，两峰完全分离(分离程度可达99.7%)
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（3）按分离原理分
仪器分析
吸附色谱（利用组分在固定相上的吸附能力强弱不同 而得以分离的方法）
分配色谱（利用组分在（固定相）中溶解度不同而达 到分离的方法称为分配色谱法）
离子交换色谱（利用组分在离子交换剂（固定相）上 的亲和力大小不同而达到分离的方法）
排阻色谱（利用大小不同的分子在多孔固定相中的选 择渗透而达到分离的方法，又称凝胶色谱法）
Y12
Y
n有效5.54(Yt1R ' 2)2
16(tR ' )2 Y
L H 有效 n有效
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仪器分析
理论优点：解释了流出曲线的形状，提出了计算和评价柱 效能高低的因素（n ） 如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱 效能越高。
理论缺点： （1）色谱过纵向扩散等不能忽略， （2）塔板理论只能定性地给出板高的概念，不能解释板 高受哪些因素影响，无法提出降低塔板高度的方法 （3）不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的 理论塔板数 （4）分配系数与浓度无关只能在有限的浓度范围内成立 （5）色谱柱中没有真正的平衡体系
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3、色谱图及常用术语
仪器分析
（1）色谱图：试样各组分经色谱分离后，从柱后流出进入检测
器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电信号（电压或 电流），再由记录仪记录下来，所得的电信号强度随时间变化的曲 线，即为流出曲线，也称为色谱图，曲线上突起部分就是色谱峰。
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仪器分析
1948, 8 days separation for 16 amino acids
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Developing of Chromatographic Technique
仪器分析
1958, 22 hours separation for 19 of amino acids
（3）流动相进入是间歇的，而非连续，每次进入为一个塔板体积
（4）所有组分开始存在于0号塔板上，而且试样沿纵向扩散不计
（5）分配系数K恒定不变
结论： n与半峰宽及峰底宽的关系 n大于50，可得到峰形基本对称的曲线 只要被分离组分K有差异，只要n足够大，
经过反复多次的分配后均可进行分离
n5.54( tR )2 16(tR)2
需的时间，也即流动相流经色谱柱所需的时间
保留时间（tR）：试样从进样到出现最大峰所需的时间 调整保留时间（tR’）：tR’=tR-t0
L t0 u
用体积表示的保留值（单位：mL） 死体积（V0）：不被固定相保留的组分，通过色谱柱所消耗的流动相
体积，由死时间确定
保留体积（VR）：试样从进样到出现最大峰所通过的流动相体积 调整保留体积（VR’）：VR’=VR-V0
仪器分析
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仪器分析
Cm：流动相传质阻力项系数，即为待测试样组分从流动相移动到固定相
表面的进行分配时所受到的阻力
Cm
0.01k'2 (1 k')2
d2p Dg
n 影响因素：容量因子k’ ，填充物平均直径dp，组分在气相中的扩散系数Dg n 结论：采用颗粒小的填充物，及分子量小的载气
仪器分析
3、色谱分离效能的衡量
柱效：色谱分离的动力学因素，由理论塔板数来衡量。如果若tR 一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。
选择性：两峰间的距离衡量色谱的选择性，距离越大选择性越好， 一般以表示
(a) 两组分没有完全分离 (b) 两组分完全分离，但柱效不高 (c) 两组分分离不完全，但柱效较好 (d) 两组分分离完全，且柱效很好
K C 分配系数
s （组分在固定相中的浓度）
C （组分在流动相中的浓度） m
k n 分配比 '
s （组分在固定相中物质的量）
n m （组分在流动相中物质的量）
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பைடு நூலகம்
仪器分析
k' nS cSVS KVS nm cmVm Vm
分配系数影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质； 温度和压力等因素。