分子酶学复习

酶学复习重点：

1、酶的基础研究：（重点）

辅因子催化机理：PLP

磷酸吡哆醛（PLP）是转氨酶与氨基酸脱羧酶的辅酶，它对蛋白质代谢具有十分重要的意义。所有转氨酶都含磷酸吡哆醛，与每一个牢固非共价键相连。磷酸吡哆醛PLP在氨基酸代谢中起重要作用：氨基转移酶（转氨酶），脱羧酶，消旋酶。

共轭双系统将吡啶环和底物连接，带正电的氮原子趋向于从氨基酸的Cα吸取电子，消弱Cα和R，H和COO—的结合，这个亲电催化的结果，可使第三个键的任何一个裂开形成负离子，又被共个系统所稳定。

1.氨基酸消旋酶：氨基酸消旋酶催化单一的立体异构体形式转变为D-或L-立体异构体消旋混合物。PLP以希夫碱键合于酶的Lys侧链氨基，并以磷酸负电荷和酶的正电荷基团静电键合。当氨基酸底物和酶结合时，希夫碱的碳原子受到底物α-氨基的亲核攻击，PLP的底物形成新的希夫碱键合，在这个配合物中已消弱的Cα-H键被裂开（亲电催化结果）释放一个质子，整个过程是可逆的。因此，质子可加于配合物，重新形成游离的氨基酸。质子起始的丢失导致Cα不对称的丧失，所以，重新产生的氨基酸未必是开始时存在的同样立体异构体。

2.氨基转移酶：从希夫碱形成到质子丢失的各个反应同上，产生的配合物在不同部位受到

H+攻击，再经水解，形成磷酸吡哆胺同时释放酮酸。

从一个不同的酮酸对磷酸吡哆胺攻击开始，可发生逆向反映，形成不同于起始存在的氨基酸。二步反应可表示为：

L-Glu+E-PLP酮戊二酸+E-PMP Oxa+E-PMP L-Asp+E-PLP

酶活性中心的鉴定方法（其中动力学分析法的具体细节掌握大概标题即可）

酶是生物大分子物质，分子量至少10000以上，但只有少数一些氨基酸残基和催化活力有关，这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心。

酶活性中心存在的实验证据：

①从抑制剂的作用推测：DFP（二异丙基氟磷酸）与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应，

不可逆抑制剂增加一倍，酶作用减少一倍。

②从酶与底物的作用证实：胰凝乳蛋白酶作用于对硝基苯酚乙酸酯，颜色深浅反应酶活性。

酶的活性部位：是指酶分子中与催化功能直接有关的氨基酸按照特定立体构象组成的活

性结构：1 酶分子上少数几个氨基酸残基组成，由肽链的盘绕折叠而成；

2 辅酶也是活性部位的重要组成部位；

3 多底物酶可能是由几个亚基组成的寡聚酶。

催化部位：在催化反应中直接参与电子收受关系的部位，直接参与催化，酶活性中心底物敏感键在此被切断或形成新键，并形成底物

底物结合部位：指与底物特异结合的有关部位，也叫特异性决定部位。

酶活性中心的研究技术：

1.化学修饰法。（最经典）

使用非特异性试剂（不能区分活性部位内和活性部位外基团）。特殊基团：某些酶的活性部位含有活性部位以外没有的氨基酸残基。对于非特殊基团，要充分利用活性部位中某一基团具有特别高的反应性的有利条件进行化学修饰。（如DFP与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应）判断标准：

(1).底物保护实验：对照试验。加底物/抑制剂，再加修饰剂；移除底物，酶去催化，若有

活性，底物起保护作用，若无活性，则说明活性中心外修饰液可以使其失活。

（活性中心失活程度与修饰剂浓度正相关）

(2).计量关系：邹氏作图法。a=x i e a是作用过程剩余的具有全部活力的酶分子的分数（活

力剩余分数），x e代表其必需基团剩余分数，i是必需基团数目。

修饰基团仅作用于一类基团，其中必须基团与非必须基团作用速度相等。

2.动力学分析法

3.生物信息学上网搜索，寻找保守区

4.定点突变法DNA shuffling（引物突变设计，重叠延伸PCR，一步反向PCR）

指改变酶分子上特定位置的残基，观察酶结构和功能的的变化，从而了解该位点的侧链基团在酶的结构和功能上的作用。随机突变：易错PCR，组合活性中心饱和突变，DNA shuffling。

5.X射线衍射法基团的相对位置和实际状态。

Domain联合分析最令人信服，但一种方法往往不能解决问题。

◆酶的柔性

诱导契合假说：当酶分子与底物接近时，酶蛋白与底物结合并不是底物与活性部位的密切互补匹配，而是在底物诱导下酶分子发生一定程度的构象变化，酶与底物发生互补契合，进行反应。酶的活性部位柔性假说：天然状态的酶具有完整的三维空间结构，其中活性部位跟其它结构部位相比，具有较大的柔性，即酶活性部位基团的运动性较大。因此，当低浓度变性剂作用时，酶分子整体刚性部分构象保持完整，而较柔性的活性部位的局部结构已发生明显变化。蛋白质（酶）并非完全刚性，局部区域具有一定的可运动性或称为柔性。对于局部柔性部位的维持必须有刚性部分来支撑。正是这种刚柔并济的独特酶分子结构，是酶的催化作用保持高效和可调性的结构基础。

◆酶的混杂性（非专一性）的概念及应用价值

定义：应用同一活性部位具有催化不同类型反应能力。

类型：①酶条件“非专一性”：在与天然条件不同的条件下，如非水介质、极端pH或温度等，

表现催化活性。

②酶底物“非专一性”：

③酶催化“非专一性”：应用不同的反应过渡态，催化不同的化学反应。

又分为两种情况：a随机性-由野生型酶催化的副反应；

b诱导性-由一个或几个突变使酶反应途径发生改变。

应用：①从进化的观点来看，酶的专一性可能是酶的“非专一性”进化的结果。酶功能的的“非专一性”可能是生物分子进化早期的普遍特征。

②酶的“非专一性”可能是分子趋异进化的起点，通过点突变可以将较低“非专一性”酶改变为高效催化剂，因此使有机体提高生存能力。

③在实验室中，“非专一性”酶可以作为产生新酶的的起点。“非专一性”功能使酶分歧进化获得高选择性和高活力。

④理解酶催化过程中底物和过渡态识别机制，为利用（scaffold of old enzymes）来产生新的催化功能。

◆酶的作用原理——解释酶专一性的理论

专一性：酶对它所催化的底物有严格的选择性，一种酶只能催化某一类反应，甚至只与某一种物质起反应。

类型：结构专一性：①绝对专一性e.g.脲酶

②族专一性或基团专一性e.g.aα-D-葡萄糖苷酶

③键专一性e.g.酯酶、一些蛋白水解酶

立体异构专一性：①旋光异构专一②几何立体异构专一性