免疫学技术 PPT
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OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产 物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致 癌性，显色反应需避光。 （2）四甲基联苯胺（TMB） TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色， 稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最 广泛。但水溶性差。
2、碱性磷酸酶（AP）
C、膜载体 NC膜（硝酸纤维素膜） 、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微 孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应 用于斑点-ELISA等。
3）ELISA方法类型及反应原理 A、双抗体夹心法 此法是检测大分子抗原的常用方法。
上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗 原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作 为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。
B、间接法 此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗 抗体检测多种抗体。
C、竞争结合法
可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检 测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相 抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中 待测抗原含量呈反比。
D、捕获法——最常用于检测IgM抗体 包被抗人IgM 链+待测标本----IgM类抗体全被 固相抗体捕获------洗涤+ 特异性抗原（针对待 测IgM的相应抗原）与固相上特异性IgM结合+ 酶标抗体（针对特异性Ag的）+底物----显色----显色表示有特异性IgM。
1） ELISA 基本原理
• 将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持 其免疫活性。
• 抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分 别保持其免疫活性和酶活性。
• 在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或 抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游 离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待 测物质含量呈相关性。
2、非均相酶免疫测定
（1）液相酶免疫测定（液相EIA）： 同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使
反应达到平衡，再加分离剂。 （2）固相酶免疫测定（固相EIA）： AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛
的是酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ——ELISA ）
2）固相载体的种类
A、塑料制品 聚苯乙烯： 蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表 面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式 专用于ELISA的微量反应板——ELISA板（812=96孔）
B、微颗粒 高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结 合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时 可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中 可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板 中完成，自动化分析。
酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
（EIA）
液相酶免疫测定
（同RIA）
（三）酶免疫测定（EIA）
1、均相酶免疫测定（HEI）
• 特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液 混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果， 整个检测过程都在均匀的液相中进行。
• 以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：
immunoelectrophoresis） 5、免疫浊度测定（immunonephelometry）
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续Fra Baidu bibliotek持安静
免疫浊度测定： 可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲 液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出 现浊度。 • 透射比浊法
散射比浊法 速率散射比浊法 终点散射比浊法
• 标记物：酶（催化底物：生物放大作用）
• 特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记 试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全 易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广 的新方法。
（一）常用的酶和酶作用底物
1、辣根过氧化物酶（HRP）
HRP来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶 （糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。 HRP常用的底物有： （1）邻苯二胺（OPD）
一定要保持抗体过量，以维持抗原－抗体复合物的相 对不溶解性。
该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液 中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、 炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物 浓度等。
第一节 免疫学检测常用标记技术
• 免疫标记技术（immunolabelling technique） 指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电 子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标 记抗体或抗原进行的抗原—抗体反应。
E、 BAS-ELISA
• 生物素（B） -亲和素（A）系统（ biotin avidin system，BAS）是以生物素和亲和 素具有的独特结合特性为基础，它们的结合 迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。
AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性 活力小于小肠粘膜活力。AP价格较HRP高， 稳定性差，但敏感度高，空白值低。
可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色 的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一 段时间（405nm）。
（二）酶免疫技术的分类
酶免疫组化 （EIH） 均相酶免疫测定（HEI）
• 优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、 定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。
• 总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的
Ag/Ab 免疫测定：定量检测液体标本中的
Ag/Ab • 也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免
疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。
一、酶免疫技术
• 基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检 测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本 中的抗原/抗体进行定量、定位分析。
免疫学技术
经典的免疫学方法： 一、凝集反应（agglutination） 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合后形成凝集团块的反应。 1、直接凝集反应 2、间接凝集反应 3、间接凝集抑制反应
二、沉淀反应（precipitation）
血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。 1、单向免疫扩散（single immunodiffusion） 2、双向免疫扩散（double immunodiffusion） 3、免疫电泳（immunoelectrophoresis） 4、火箭免疫电泳（rocket
2、碱性磷酸酶（AP）
C、膜载体 NC膜（硝酸纤维素膜） 、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微 孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应 用于斑点-ELISA等。
3）ELISA方法类型及反应原理 A、双抗体夹心法 此法是检测大分子抗原的常用方法。
上述方法亦可改为双位点一步法，使用针对抗 原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作 为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。
B、间接法 此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗 抗体检测多种抗体。
C、竞争结合法
可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检 测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相 抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中 待测抗原含量呈反比。
D、捕获法——最常用于检测IgM抗体 包被抗人IgM 链+待测标本----IgM类抗体全被 固相抗体捕获------洗涤+ 特异性抗原（针对待 测IgM的相应抗原）与固相上特异性IgM结合+ 酶标抗体（针对特异性Ag的）+底物----显色----显色表示有特异性IgM。
1） ELISA 基本原理
• 将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持 其免疫活性。
• 抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分 别保持其免疫活性和酶活性。
• 在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或 抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游 离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待 测物质含量呈相关性。
2、非均相酶免疫测定
（1）液相酶免疫测定（液相EIA）： 同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使
反应达到平衡，再加分离剂。 （2）固相酶免疫测定（固相EIA）： AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛
的是酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ——ELISA ）
2）固相载体的种类
A、塑料制品 聚苯乙烯： 蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表 面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式 专用于ELISA的微量反应板——ELISA板（812=96孔）
B、微颗粒 高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结 合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时 可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中 可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板 中完成，自动化分析。
酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
（EIA）
液相酶免疫测定
（同RIA）
（三）酶免疫测定（EIA）
1、均相酶免疫测定（HEI）
• 特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液 混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果， 整个检测过程都在均匀的液相中进行。
• 以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：
immunoelectrophoresis） 5、免疫浊度测定（immunonephelometry）
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续Fra Baidu bibliotek持安静
免疫浊度测定： 可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲 液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出 现浊度。 • 透射比浊法
散射比浊法 速率散射比浊法 终点散射比浊法
• 标记物：酶（催化底物：生物放大作用）
• 特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记 试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全 易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广 的新方法。
（一）常用的酶和酶作用底物
1、辣根过氧化物酶（HRP）
HRP来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶 （糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。 HRP常用的底物有： （1）邻苯二胺（OPD）
一定要保持抗体过量，以维持抗原－抗体复合物的相 对不溶解性。
该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液 中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、 炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物 浓度等。
第一节 免疫学检测常用标记技术
• 免疫标记技术（immunolabelling technique） 指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电 子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标 记抗体或抗原进行的抗原—抗体反应。
E、 BAS-ELISA
• 生物素（B） -亲和素（A）系统（ biotin avidin system，BAS）是以生物素和亲和 素具有的独特结合特性为基础，它们的结合 迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。
AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性 活力小于小肠粘膜活力。AP价格较HRP高， 稳定性差，但敏感度高，空白值低。
可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色 的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一 段时间（405nm）。
（二）酶免疫技术的分类
酶免疫组化 （EIH） 均相酶免疫测定（HEI）
• 优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、 定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。
• 总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的
Ag/Ab 免疫测定：定量检测液体标本中的
Ag/Ab • 也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免
疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。
一、酶免疫技术
• 基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检 测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本 中的抗原/抗体进行定量、定位分析。
免疫学技术
经典的免疫学方法： 一、凝集反应（agglutination） 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合后形成凝集团块的反应。 1、直接凝集反应 2、间接凝集反应 3、间接凝集抑制反应
二、沉淀反应（precipitation）
血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。 1、单向免疫扩散（single immunodiffusion） 2、双向免疫扩散（double immunodiffusion） 3、免疫电泳（immunoelectrophoresis） 4、火箭免疫电泳（rocket