转录因子ZEB1和ZEB2在肝纤维化大鼠肝组织中表达的研究
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近年的研究表明 EMT 与哺乳动物胚胎发育与神经系统分化有密切的关系,且在 肾小管纤维化、肺间质纤维化和腹膜纤维化发病过程中具也有重要作用[7-9]，还能够 增强肿瘤的侵袭、侵润和转移能力，因此也与肿瘤的发病有密切关系[10、11]。ZEB1 和 ZEB2 通过对其下游靶基因的调控促进 EMT，进而对疾病的发生发展起到重要的 调控作用，如肿瘤的转移和侵袭力提高以及脏器纤维化促进作用。随着研究的深入， 有关 ZEB1 和 ZEB2 在肿瘤和脏器纤维化中的作用已取得了一些进展，如叶勇等用石
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贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
蜡切片原位杂交检测原发性肝癌组织 ZEB2 表达的研究发现，肝癌组织 ZEB2 的 DNA 阳性表达多而 E-cadherin 的 DNA 阳性表达少，正常肝组织 ZEB2 的 DNA 阳性表达 少而 E-cadherin 的 DNA 阳性表达多，且原发性肝细胞癌中 ZEB2 的表达阳性与门静 脉有无癌栓及包膜侵犯呈显著正相关，提示 ZEB2 能通过抑制 E-cadherin 的表达引 起肝癌细胞发生 EMT 而促进肿瘤的转移[2]。Kim 等用肺泡上皮细胞株 A549 进行的 研究发现肺泡上皮细胞向间质细胞转型是纤维化局灶成纤维细胞的重要来源，并且 发生转化的细胞 SIP1(即转录因子 ZEB2)的表达量增多，提示 SIP1 作为一种参与 EMT 的关键转录因子,与肺纤维化发生密切相关[12]。
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减少，同时间质细胞特征蛋白 a-SMA 在纤维间隔和部分肝细胞内表达显著增多， 提示在大鼠肝纤维化发生过程中有部分肝细胞发生了 EMT 转变；我们认为可能是 转录因子 ZEB1 和 ZEB2 表达上调通过抑制其下游靶基因 E-cadherin 转录，导致部 分肝细胞发生 EMT 转化而参与肝纤维化的发生发展。 关键词：大鼠；肝纤维化；E-钙粘素；上皮间质样转化；ZEB1；ZEB2
略缩词表 ................................................ 32 论文原创性声明 .......................................... 33 附：综述 ................................................ 34
2012 年 3 月 16 日
贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
目录
摘 要 ................................................. 1 前 言 ................................................. 3 材 料 ................................................. 5 方 法 ................................................. 6 结 果 ................................................ 11 讨 论 ................................................ 18 参考文献 ................................................ 23 英文摘要 ................................................ 29 致 谢 ................................................ 31
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转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化大鼠肝组织中表达的研究
病理学与病理生理学 研究生：张成俊 导师：杨勤 教授
摘要：目的：观察 CCl4 致大鼠肝纤维化发生过程中转录因子 ZEB1 和 ZEB2 的表达变 化，探讨转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在大鼠肝纤维化发病机制中可能的作用。方法：雄 性 Wistar 大鼠 32 只，随机分为正常对照 4 周组、正常对照 8 周组、肝纤维化 4 周 组和肝纤维化 8 周组。大鼠肝纤维化模型制备采用皮下注射 60%四氯化碳（CCl4） 方法进行。实验结束时测定肝脏指数及血清谷丙、谷草转氨酶(ALT、AST) 含量，观 察肝组织纤维化程度，免疫组化 SABC 法检测肝组织中转录因子 ZEB1、ZEB2 和 a-SMA 的表达情况，并用 Realtime-PCR 检测肝组织中 ZEB1、ZEB2mRNA 和 E-钙黏蛋白 mRNA 的表达变化。结果：肝纤维化 4 周组、8 周组大鼠的肝脏指数、血清 ALT、AST 含量 明显高于相应正常对照组大鼠（P＜0.01）；病理学检查显示肝纤维化组大鼠肝脏纤 维结缔组织明显增多，且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏纤维化程度较 4 周组严重，有假 小叶形成；免疫组化显示肝纤维化 4 周、8 周组大鼠肝组织中 ZEB1 和 ZEB2 主要表达 在肝细胞的胞浆中，表达量均较相应正常对照组显著增加（P＜0.01），且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏 ZEB1 和 ZEB2 表达量较肝纤维化 4 周组有显著增加（P＜0.01）；肝纤维 化 4 周、8 周组大鼠肝组织中 a-SMA 主要表达在纤维间隔和邻近的肝细胞胞浆中， 表达量较相应正常对照组显著增加（P＜0.01），且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏 a-SMA 表达量较肝纤维化 4 周组也有显著增加（P＜0.01）。RT-PCR 检测结果显示肝纤维化 4 周和 8 周组大鼠肝组织 ZEB1 和 ZEB2 mRNA 表达量显著高于相应 4 周和 8 周正常对照 组（P＜0.01），ZEB1 和 ZEB2 mRNA 在肝纤维化 8 周组大鼠肝脏的表达量较肝纤维化 4 周组略有降低，但二者相比无统计学差异（P＞0.05）；同时肝纤维化 4 周和 8 周组 大鼠肝组织 E-cadherin 的 mRNA 表达量显著低于正常对照组（P＜0.05），且肝纤维 化 8 周组大鼠肝脏 E-cadherin mRNA 的表达量较肝纤维化 4 周组进一步下降（P＜ 0.05）。结论: 肝细胞转录因子 ZEB1 和 ZEB2 蛋白及基因表达水平在 CCl4 诱导肝纤维 化发生过程中显著增加，提示转录因子 ZEB1 和 ZEB2 可能参与了肝纤维化的发生发 展；本研究还发现纤维化大鼠肝脏上皮细胞特征蛋白 E-cadherin mRNA 表达显著
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1.前 言
ZEB1（zinc-finger E-box-binding homeobox1 ）和 ZEB2（zinc-finger E-box-binding homeobox2）都是锌指结构蛋白，广泛的存在于各种生物体内，是一类核转录因子， 能够调控下游靶基因的转录。ZEB1 和 ZEB2 属于 ZEB 家族均有 N 端和 C 端两个锌 指结构簇，通过其 N 端锌指结构簇和 C 端锌指结构簇中的锌指结构与含有 CACCT 的 E-BOX 序列和 CACCT(G)的 E-BOX 相似序列结合，进而调控下游靶基因的表达 。 [1、2]
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2.材料与方法
2.1 2.1.1
材料 动物 雄性 Wistar 大鼠 32 只，清洁级，体重 180±20g，贵阳医学院实验动物中心 提供。
2.1.2 药品和主要试剂 （1）四氯化碳（CCl4）分析纯 (成都金山化学试剂有限公司，100410）。 （2）锌指 E 盒结合蛋白 1（ZEB1）兔多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司， bs-4187R）。 （3）锌指 E 盒结合蛋白 2（ZEB2）兔多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司， bs-1130R） （ 4 ） 二 氨 基 联 苯 胺 （ DAB ） 显 色 试 剂 盒 （ 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ， ZLI-9032）。 （5）SABC（兔 IgG）-POD 试剂盒（武汉博士德公司，SA1022）。 （6）无水乙醇（上海振兴化工一厂，100122）。 （7）3%过氧化氢（贵州宏泰工贸公司保健厂，20080701）。 （8）二甲苯（重庆川江化学试剂厂，20081018）。 （9）磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9062）。 （10）柠檬酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9065）。 （11）谷丙转氨酶（GPT/ALT）测试盒（南京建成生物工程研究所，C009-2） （12）谷草转氨酶（GOT/AST）测试盒（南京建成生物工程研究所，C010-2） （13） RT-PCR 所需的 Oligo d(T)、MuLv Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、 10×PCR Buffer、dNTP、SYBR Green PCR Master Mix 均由美国国立卫生院 刘杰博士惠赠。
EMT 是指上皮细胞在特定的生理或病理情况下，上皮细胞特异性蛋白如 E-cadherin 表达减少,而间质细胞特征蛋白 a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)等表达增多, 逐渐丧失其上皮细胞特性，并表现出间质细胞特征，这种上皮细胞转化为间质细胞 的过程称为上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），发生 EMT 的细胞分泌间质特征蛋白、胶原等增多，导致生成 ECM 增多[6]。
有关肝纤维化发病机制目前仍不十分清楚。肝纤维化是机体对各种病因引起的 慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，以肝脏内弥散性的细胞外基质的沉积为主要特 征。以往的研究认为肝星状细胞（hepatic stellate cells ，HSC）激活转化为肌成纤 维细胞（Myofibroblast cell, MFLC）是肝纤维化发生过程中的中心环节[14、15]。最近 有研究发现为数众多的肝细胞通过 EMT 转化为肌成纤维细胞，合成分泌胶原等导致 细胞外基质增多可能也是肝纤维化发病的重要基础[16]。Zeisberg 等研究发现转化生 长因子-β(TGF-β)能诱导肝细胞株及原代小鼠肝细胞 E-cadherin 表达下调，间质细 胞的标志蛋白如 I 型胶原蛋白、波形蛋白及 a-平滑肌肌动蛋白表达上调，并使细胞 获得迁移表型,提示 TGF-β 能诱导肝细胞发生 EMT[17]。但关于肝纤维化发生过程中 肝细胞 EMT 转化及其调控仍不十分清楚。有关转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化 发生过程中的作用，目前国内外还未见研究报道。因此本研究以转录调控因子 ZEB1 和 ZEB2 作为切入点，观察在肝纤维化发生过程中肝细胞 ZEB1 和 ZEB2 基因与蛋白 的表达的变化，探讨其与肝细胞 EMT 转化的关系，旨在深入探讨有关 ZEB1 和 ZEB2 对肝细胞 EMT 转化调控在肝纤维化发生机制中可能的作用。
贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
《中国图书资料分类法》 分类号：R363
Biblioteka Baidu
单位代码：10660 学 号： S090055
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转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化大鼠肝组 织中表达的研究
研 究 生： 张 成 俊 导 师： 杨 勤 教授 年 级： 2009 级 专 业： 病理学与病理生理学
E-cadherin(E-钙粘蛋白)是一种相对分子量为 120KD 的钙依赖性跨膜糖蛋白， 属于Ⅰ型钙粘素，是 ZEB1 和 ZEB2 调控的下游靶基因之一。E-cadherin 是上皮细胞 重要的粘附成分，也是上皮细胞的标志蛋白之一[3]。研究发现 E-cadherin 基因的启 动子序列中含有 E-box（CACCTC/G）序列，ZEB1 和 ZEB2 能与上皮细胞中的 E-cadherin 基因的启动子上的 E-BOX 序列结合，抑制 E-cadherin 在上皮细胞中的表 达，导致上皮细胞间链接减少失去其表型特征，并表达间质细胞的特征蛋白如α平 滑肌肌动蛋白（α-SMA），出现间质细胞表型特征，这种上皮细胞转化成间质细胞 的过程称为上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），ZEB1 和 ZEB2 能通过对 E-cadherin 的抑制作用促进上皮细胞 EMT 的发生[4、5]。
我国病毒性肝炎的发病率很高。据统计我国乙肝表面抗原携带者约有 1.2 亿人， 占全世界肝炎总数的 80%，其中有 14.2%可演变为肝硬化；丙型肝炎流行率约为 3.2%，其中约有 80%左右转变成肝硬化；此外近年来中老年人酒精性肝硬化的发病 率也逐渐增高，肝硬化的年发病率为 17/10 万，由慢性肝病所致肝纤维化甚至肝癌 对人们的身体健康和国民经济的发展造成了重大影响。上个世纪末有学者提出慢性 肝病在未进入肝硬化之前的肝纤维化阶段尚有逆转的可能，因此有关肝纤维化发生 的分子生物学机制研究机防治措施研究一直是肝病学研究的热点之一[13]。
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蜡切片原位杂交检测原发性肝癌组织 ZEB2 表达的研究发现，肝癌组织 ZEB2 的 DNA 阳性表达多而 E-cadherin 的 DNA 阳性表达少，正常肝组织 ZEB2 的 DNA 阳性表达 少而 E-cadherin 的 DNA 阳性表达多，且原发性肝细胞癌中 ZEB2 的表达阳性与门静 脉有无癌栓及包膜侵犯呈显著正相关，提示 ZEB2 能通过抑制 E-cadherin 的表达引 起肝癌细胞发生 EMT 而促进肿瘤的转移[2]。Kim 等用肺泡上皮细胞株 A549 进行的 研究发现肺泡上皮细胞向间质细胞转型是纤维化局灶成纤维细胞的重要来源，并且 发生转化的细胞 SIP1(即转录因子 ZEB2)的表达量增多，提示 SIP1 作为一种参与 EMT 的关键转录因子,与肺纤维化发生密切相关[12]。
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减少，同时间质细胞特征蛋白 a-SMA 在纤维间隔和部分肝细胞内表达显著增多， 提示在大鼠肝纤维化发生过程中有部分肝细胞发生了 EMT 转变；我们认为可能是 转录因子 ZEB1 和 ZEB2 表达上调通过抑制其下游靶基因 E-cadherin 转录，导致部 分肝细胞发生 EMT 转化而参与肝纤维化的发生发展。 关键词：大鼠；肝纤维化；E-钙粘素；上皮间质样转化；ZEB1；ZEB2
略缩词表 ................................................ 32 论文原创性声明 .......................................... 33 附：综述 ................................................ 34
2012 年 3 月 16 日
贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
目录
摘 要 ................................................. 1 前 言 ................................................. 3 材 料 ................................................. 5 方 法 ................................................. 6 结 果 ................................................ 11 讨 论 ................................................ 18 参考文献 ................................................ 23 英文摘要 ................................................ 29 致 谢 ................................................ 31
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转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化大鼠肝组织中表达的研究
病理学与病理生理学 研究生：张成俊 导师：杨勤 教授
摘要：目的：观察 CCl4 致大鼠肝纤维化发生过程中转录因子 ZEB1 和 ZEB2 的表达变 化，探讨转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在大鼠肝纤维化发病机制中可能的作用。方法：雄 性 Wistar 大鼠 32 只，随机分为正常对照 4 周组、正常对照 8 周组、肝纤维化 4 周 组和肝纤维化 8 周组。大鼠肝纤维化模型制备采用皮下注射 60%四氯化碳（CCl4） 方法进行。实验结束时测定肝脏指数及血清谷丙、谷草转氨酶(ALT、AST) 含量，观 察肝组织纤维化程度，免疫组化 SABC 法检测肝组织中转录因子 ZEB1、ZEB2 和 a-SMA 的表达情况，并用 Realtime-PCR 检测肝组织中 ZEB1、ZEB2mRNA 和 E-钙黏蛋白 mRNA 的表达变化。结果：肝纤维化 4 周组、8 周组大鼠的肝脏指数、血清 ALT、AST 含量 明显高于相应正常对照组大鼠（P＜0.01）；病理学检查显示肝纤维化组大鼠肝脏纤 维结缔组织明显增多，且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏纤维化程度较 4 周组严重，有假 小叶形成；免疫组化显示肝纤维化 4 周、8 周组大鼠肝组织中 ZEB1 和 ZEB2 主要表达 在肝细胞的胞浆中，表达量均较相应正常对照组显著增加（P＜0.01），且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏 ZEB1 和 ZEB2 表达量较肝纤维化 4 周组有显著增加（P＜0.01）；肝纤维 化 4 周、8 周组大鼠肝组织中 a-SMA 主要表达在纤维间隔和邻近的肝细胞胞浆中， 表达量较相应正常对照组显著增加（P＜0.01），且肝纤维化 8 周组大鼠肝脏 a-SMA 表达量较肝纤维化 4 周组也有显著增加（P＜0.01）。RT-PCR 检测结果显示肝纤维化 4 周和 8 周组大鼠肝组织 ZEB1 和 ZEB2 mRNA 表达量显著高于相应 4 周和 8 周正常对照 组（P＜0.01），ZEB1 和 ZEB2 mRNA 在肝纤维化 8 周组大鼠肝脏的表达量较肝纤维化 4 周组略有降低，但二者相比无统计学差异（P＞0.05）；同时肝纤维化 4 周和 8 周组 大鼠肝组织 E-cadherin 的 mRNA 表达量显著低于正常对照组（P＜0.05），且肝纤维 化 8 周组大鼠肝脏 E-cadherin mRNA 的表达量较肝纤维化 4 周组进一步下降（P＜ 0.05）。结论: 肝细胞转录因子 ZEB1 和 ZEB2 蛋白及基因表达水平在 CCl4 诱导肝纤维 化发生过程中显著增加，提示转录因子 ZEB1 和 ZEB2 可能参与了肝纤维化的发生发 展；本研究还发现纤维化大鼠肝脏上皮细胞特征蛋白 E-cadherin mRNA 表达显著
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1.前 言
ZEB1（zinc-finger E-box-binding homeobox1 ）和 ZEB2（zinc-finger E-box-binding homeobox2）都是锌指结构蛋白，广泛的存在于各种生物体内，是一类核转录因子， 能够调控下游靶基因的转录。ZEB1 和 ZEB2 属于 ZEB 家族均有 N 端和 C 端两个锌 指结构簇，通过其 N 端锌指结构簇和 C 端锌指结构簇中的锌指结构与含有 CACCT 的 E-BOX 序列和 CACCT(G)的 E-BOX 相似序列结合，进而调控下游靶基因的表达 。 [1、2]
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贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
2.材料与方法
2.1 2.1.1
材料 动物 雄性 Wistar 大鼠 32 只，清洁级，体重 180±20g，贵阳医学院实验动物中心 提供。
2.1.2 药品和主要试剂 （1）四氯化碳（CCl4）分析纯 (成都金山化学试剂有限公司，100410）。 （2）锌指 E 盒结合蛋白 1（ZEB1）兔多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司， bs-4187R）。 （3）锌指 E 盒结合蛋白 2（ZEB2）兔多克隆抗体（北京博奥森生物工程有限公司， bs-1130R） （ 4 ） 二 氨 基 联 苯 胺 （ DAB ） 显 色 试 剂 盒 （ 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ， ZLI-9032）。 （5）SABC（兔 IgG）-POD 试剂盒（武汉博士德公司，SA1022）。 （6）无水乙醇（上海振兴化工一厂，100122）。 （7）3%过氧化氢（贵州宏泰工贸公司保健厂，20080701）。 （8）二甲苯（重庆川江化学试剂厂，20081018）。 （9）磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9062）。 （10）柠檬酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9065）。 （11）谷丙转氨酶（GPT/ALT）测试盒（南京建成生物工程研究所，C009-2） （12）谷草转氨酶（GOT/AST）测试盒（南京建成生物工程研究所，C010-2） （13） RT-PCR 所需的 Oligo d(T)、MuLv Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、 10×PCR Buffer、dNTP、SYBR Green PCR Master Mix 均由美国国立卫生院 刘杰博士惠赠。
EMT 是指上皮细胞在特定的生理或病理情况下，上皮细胞特异性蛋白如 E-cadherin 表达减少,而间质细胞特征蛋白 a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)等表达增多, 逐渐丧失其上皮细胞特性，并表现出间质细胞特征，这种上皮细胞转化为间质细胞 的过程称为上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），发生 EMT 的细胞分泌间质特征蛋白、胶原等增多，导致生成 ECM 增多[6]。
有关肝纤维化发病机制目前仍不十分清楚。肝纤维化是机体对各种病因引起的 慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，以肝脏内弥散性的细胞外基质的沉积为主要特 征。以往的研究认为肝星状细胞（hepatic stellate cells ，HSC）激活转化为肌成纤 维细胞（Myofibroblast cell, MFLC）是肝纤维化发生过程中的中心环节[14、15]。最近 有研究发现为数众多的肝细胞通过 EMT 转化为肌成纤维细胞，合成分泌胶原等导致 细胞外基质增多可能也是肝纤维化发病的重要基础[16]。Zeisberg 等研究发现转化生 长因子-β(TGF-β)能诱导肝细胞株及原代小鼠肝细胞 E-cadherin 表达下调，间质细 胞的标志蛋白如 I 型胶原蛋白、波形蛋白及 a-平滑肌肌动蛋白表达上调，并使细胞 获得迁移表型,提示 TGF-β 能诱导肝细胞发生 EMT[17]。但关于肝纤维化发生过程中 肝细胞 EMT 转化及其调控仍不十分清楚。有关转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化 发生过程中的作用，目前国内外还未见研究报道。因此本研究以转录调控因子 ZEB1 和 ZEB2 作为切入点，观察在肝纤维化发生过程中肝细胞 ZEB1 和 ZEB2 基因与蛋白 的表达的变化，探讨其与肝细胞 EMT 转化的关系，旨在深入探讨有关 ZEB1 和 ZEB2 对肝细胞 EMT 转化调控在肝纤维化发生机制中可能的作用。
贵阳医学院 2012 届硕士学位论文
《中国图书资料分类法》 分类号：R363
Biblioteka Baidu
单位代码：10660 学 号： S090055
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转录因子 ZEB1 和 ZEB2 在肝纤维化大鼠肝组 织中表达的研究
研 究 生： 张 成 俊 导 师： 杨 勤 教授 年 级： 2009 级 专 业： 病理学与病理生理学
E-cadherin(E-钙粘蛋白)是一种相对分子量为 120KD 的钙依赖性跨膜糖蛋白， 属于Ⅰ型钙粘素，是 ZEB1 和 ZEB2 调控的下游靶基因之一。E-cadherin 是上皮细胞 重要的粘附成分，也是上皮细胞的标志蛋白之一[3]。研究发现 E-cadherin 基因的启 动子序列中含有 E-box（CACCTC/G）序列，ZEB1 和 ZEB2 能与上皮细胞中的 E-cadherin 基因的启动子上的 E-BOX 序列结合，抑制 E-cadherin 在上皮细胞中的表 达，导致上皮细胞间链接减少失去其表型特征，并表达间质细胞的特征蛋白如α平 滑肌肌动蛋白（α-SMA），出现间质细胞表型特征，这种上皮细胞转化成间质细胞 的过程称为上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），ZEB1 和 ZEB2 能通过对 E-cadherin 的抑制作用促进上皮细胞 EMT 的发生[4、5]。
我国病毒性肝炎的发病率很高。据统计我国乙肝表面抗原携带者约有 1.2 亿人， 占全世界肝炎总数的 80%，其中有 14.2%可演变为肝硬化；丙型肝炎流行率约为 3.2%，其中约有 80%左右转变成肝硬化；此外近年来中老年人酒精性肝硬化的发病 率也逐渐增高，肝硬化的年发病率为 17/10 万，由慢性肝病所致肝纤维化甚至肝癌 对人们的身体健康和国民经济的发展造成了重大影响。上个世纪末有学者提出慢性 肝病在未进入肝硬化之前的肝纤维化阶段尚有逆转的可能，因此有关肝纤维化发生 的分子生物学机制研究机防治措施研究一直是肝病学研究的热点之一[13]。