方法学评价实验— 重复性实验

显著性水平
0.05
0.01
2.834
3.204
2.845
3.216
2.856
3.228
2.867
3.239
2.877
3.250
2.886
3.261
2.896
3.272
2.905
3.282
2.914
3.292
2.923
3.301
2.931
3.310
2.940
3.319
2.948
3.328
2.956
3.337
【原始数据记录】
次数
1
2
3
4
轮数
1
2
3
4
5
【数据处理】
Au
血清葡萄糖（mmol/L）= As
× 5.55
次数
1
2
3
4
轮数
1
2
3 4
5
1. 检验20次测定数据中的离群值，如存在异常值应剔除。对
小样本量的测定，可以用Grubbs检验，其统计学公式是：
Xd X
G=
S
Xd为离群值；X、s分别为包括离群值在内的均值、标准差，
2.本法用血量甚微，操作中应先加试剂后加标本，再吸试剂 反复冲洗吸管（3次）
3.使用微量进样器前应浸在溶液中来回拉几次，将针尖内气 泡排尽。使用时容量指示芯拉动不得超过商标图案，谨防 拉出。使用后应立刻进行清洗，防止芯子卡死、针尖堵塞。
【操作步骤】 血清样本按照前述HK法血糖测定方法
进行20次（5轮4次）验
二 方法学评价实验-重复性试验
1、精密度：是指同一标本在一定条件下多次重复测定得到的一系列单次测定值
之 间接近程度。反应随机误差大小的指标，重复性试验是评价方法精 密度的常用方法。
2、重复性试验：将同一份标本分成数份实验标本，进行多次分析测定
（一般为20次），目的在于评价或验证试验方法的随机误差或 不精密度。
HK法
加入物质（ml） 血清 葡萄糖标准液 去离子水 HK工作液
B（空白管）
0.02 1.0
S（标准管） U（标本管） 0.02
0.02
1.0
1.0
混匀，37 ℃水浴，10分钟，340nm测吸光度
↓↓ 0μl 20μl
微量进样器 量程0-100μl
【注意事项】
1.测定标本以草酸钾-氟化钠为抗凝剂的血浆较好。因为其 不仅能抗凝，还能抑制糖分解
3.03
3.41
（1）只有一个离群值的情况：设有n个测定数（X1<‥<Xn)，其中X1 为离群值，即可利用上述公式，直接对X1进行检验。
（2）如果离群值是两个或两个以上，分布在均数的同一侧，例如X1、 X2都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据（X2），即通过检验决 定X2是否应该舍弃。如果X2应该舍弃，X1自然该舍弃。如果X2不应 舍去，再检验X1。
所以1/4*10%=2.5% 即CV小于等于2.5% ？？？？
严重溶血Hb 2-5.12g/L致使红细胞内有机磷脂酸及一些酶类释放，消耗NADP+，可使葡萄糖测
定值下降。
精密度通常以“不精密度”【标准差和变异系数（CV）】来度量。变异系数越大，精密度越低。
显著水平a 要求越严格 a值越小 严格a=0.01 不严格a=0.05？？？但是不严格剔除数目更多
（3）如果离群值是两个或两个以上，分布于均数两侧，则分别检验 X1和Xn是否应该舍去。如有一个数据决定舍去，那么再检验另一个数 据时，测定次数应该作为减少一次来处理，而且此时应选择99%的置 信水平
2.按照批内精密度的计算公式计算 5 轮每轮 4 次测定
值的平均数 、标准差 (S) 和变异系数 (CV )
医学决定水平2.8、7.0、11.2mmol/L （6.7？？？）
美国实验室临床实验室修正案CLIA^88推荐的临床化学项目的允许总误差TEa
医学决定水平 2.8mmol/L 7.0mmol/L 11.2mmol/L
TEa
0.336μmol/L 10%
10%
批内不精密度 CV变异系数或标准差小于或等于TEa的1/4
确定离群值 可疑值不是最大就是最小值 计算均值 将2个可疑值跟均值比较 从而确定一个最
终的可疑值 计算G 如果G大于Grubbs表中的临界值 则可以剔除 但是临界值与检出水平和测
量次数n有关
【试剂与器材】
1. HK法测定血清葡萄糖试剂盒 2. 5.55mmol/L葡萄糖标准液 3. 分光光度计 4. 水浴箱 5. 试管、吸管等 6. 临床样本：根据医学决定水平收集临床混合血清样本三份
（2.8、6.7、11.1mmol/L） （无肉眼可见溶血、脂血、黄疸）
HK工作液配制：4R1 + 1R2
如果计算的G值大于系数表中相应显著性水平的a和测定次数
n时的临界值Ga.n，则将Xd作为异常值舍去。
测定次数 (n) 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20
21 22 23 24 25
显著性水平
0.05
0.01
2.234
2.484
2.285
2.549
2.331
2.607
2.372
一、己糖激酶法测定血清葡萄糖
HK法测定葡萄糖的原理
己糖激酶
葡萄糖 + ATP ←－－→ 葡萄糖-6-磷酸 + ADP 葡萄糖-6-磷酸+NADP+←葡－萄糖－-－6-磷－酸－脱氢－酶→6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+
还原型NADPH的生成与葡萄糖浓度成正比， 在波长340nm监测NADPH吸光度，可计算血清中葡萄糖的含量。
2.658
2.409
2.705
2.443
2.747
2.475
2.785
2.504
2.821
2.531
2.853
2.557
2.580
2.884
2.912
2.603
2.939
2.624
2.963
2.644
2.987
2.663
3.009
测定次数 (n) 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 60
TEa = ±1/4[（参考值上限 – 参考值下限）/参考值均值]×100%
【注意事项】
1.为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加人标准液及标本量， 并严格控制反应时间，准确读数。 2. 引起偶然误差的原因很多，仪器、温度、吸量、混匀、标准品的稳 定性等等，应排除这些因素后才能把误差归于方法学。 3.用于评价方法精密度的变异系数应该是剔除离群值之后计算得到的。
3、批内重复性试验：在尽可能短的时间内进行5轮，每轮4次测定 4、日内重复性试验：在一天内作5轮，每轮4次，获得20个数据。 5、日间重复性试验：每天测定一 份，连测20天。
原理
将同一份标本分成数份，在相同条件下（用同样的方法， 同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人 操作），在尽可能短的时间内进行 m 轮，每轮 n 次重复测 定，以获得批内精密度数据的试验方法（一般为20次，5轮， 每轮4次）。其结果能反映各次测定结果互相接近的程度，用 于客观评价测定方法随机误差的大小。
（1）批内均数=
每轮测定值均数之和 X 测定轮数 (m)
（2）批内标准差（Sw）= Si 2
m
式中 Si2 为 5 轮各次测定值的方差，即：
Si2=
(X i X )2 n 1
(3)变异系数(CV%)＝
批内标准差 Sw
批内均数X
×100%
【评价标准】
批内不精密度的判断限是1/4允许总误差（TEa）范围，小于或等于判断 限的，检测系统的不精密度可接受；大于判断限的表示不精密度不符合要求。 允许误差范围可根据CLIA88规定的能力比对试验的TEa确定，血糖的可接受范 围是靶值±0.33mmol/L，或CV<2.5%则方法精密度可接受。