2015春 第七章 酶的非水相催化 to students

枯草杆菌蛋白酶
核糖核酸酶 酸性磷酸酶 腺苷三磷酸酶 ( F1-ATPase) 限制性核酸内切酶 （Hind Ⅲ） β-葡萄糖苷酶 溶菌酶
正辛烷，110℃
壬烷，110℃，6 h 水，pH 8.0, 90℃ 正十六烷，80℃ 水，70℃ 甲苯，70℃ 水， 60℃ 正庚烷，55℃，30d 2-丙醇，50℃，30 h 环己烷，110℃ 水
water)。
水对有机介质中酶催化反应的影响
2 . 水含量对酶催化反应速度的影响
有机介质中水含量与反应速率的 关系 最适水含量随着溶剂极性的增加 而增加 反应体系的最适水含量与酶的种 类、有机溶剂的种类等变化而有 所差别。
猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚 醇转酯反应速率与水浓度的关系
必需水对酶活的影响：
T1/2 = 80 min
活力剩余95％ T1/2 < 10 min T1/2 = 8 min T1/2 = 1 min T1/2 > 24 h T1/2 < 10 min 活力不降低 活力剩余80％ T1/2 =140 min T = 10 min
2. 酶在有机介质中的底物特异性与选择性
2.1 底物专一性 在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位 与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的 底物特异性会发生改变。
是否存在非水介质能保证酶催化？？
长期的观点认为:
有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思
想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几 乎毫无进展。 • 20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。
• 1984年， A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic
Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生
的高压容器，并且减压时易于使酶失活。此外， 有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表 面的活泼基团发生反应而引起酶活性的丧失。

性质（1）超临界流体的P-V-T性质
乙烷 丙烷 丁烷 戊烷 乙烯 氨 CO2 二氧化 硫 157.6 水
流体名称 临界温度 （℃） 临界压力 （Mpa） 临界密度 (g/cm3)
高的酶活力
3 . 有机溶剂对底物和产物分配的影响
有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度
一般选用2<=lgP<=5的有机溶剂作为有机介质适宜
水 酶
有机溶剂
七、非水介质中酶的性质
由于受到非水介质的影响，改变底物存 在的状态及酶与底物相结合的自由能，从 而影响到酶的一些主要性质。
1. 热力学稳定性
八、有机介质中酶催化反应的影响因素 及其控制
1、酶的种类及浓度
不是所有的酶都能在有机溶剂中催化反应的。 已报道的酶类有：脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、 醛缩酶、多酚氧化酶、醇脱氢酶ATP酶、细胞色 素氧化酶、胆固醇氧化酶等。
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2.有机溶剂的选择
• 有机溶剂的极性：疏水性参数 lgP
lgP↓，疏水性↓
乙腈
甲苯
1，4-二丁酰基-2-辛基苯
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2.4 键选择性
• 键选择性：同一个底物分子中有两种以上化学键 可与酶反应，酶对其中一种优先反应。 • 例：6- 氨基-1-己醇的选择性酰基化
6-氨基-1-己醇
3. 分子记忆
分子记忆 • 根据分子识别理论，酶与配体的诱导、相互作用 改变酶的构象，能够获得与配体类似物结合能力 的酶，这种由配体诱导产生酶记忆的方法，称为 分子记忆（molecular memory)
水的重要性：水是酶分子的“润滑剂”。 必需水：水是酶催化反应的必需条件，维持分子完整 的空间构象所必需的最低水量称为“必需水” （essential 各酶必需水含量不一，通常<1%，如猪胰脂肪酶（催 化三丁酸甘油酯）为0.95％。 提示：必需水在酶反应中并非直接参与者，只起维持 酶活性构象作用。
三、酶非水相催化的主要特点
a. 酶结构刚性增强，空间构象更加稳定
1. 酶的热稳定性提高
b. 水含量有限（酶分子的不可逆变性过 程中，水是一个必要的参与者）
2. 酶的催化活性有所降低 3. 水解酶可以在非水介质中 催化水解反应的逆反应
R COOCH2CH3 H2O RCOOH CH3CH2OH
4. 非极性底物或者产物的溶解度增加 5. 酶的底物特异性和选择性有所改变
对配体的记忆功能
有机相生物印迹酶
冻干 枯草杆菌蛋白酶溶液 （1） 含N-Ac-Tyr-NH2 冻干 枯草杆菌蛋白酶溶液 （2） 不含N-Ac-Tyr-NH2 除去抑制剂 枯草杆菌 蛋白酶
枯草杆菌 蛋白酶
在辛烷中催化酯化反应的速度比较： 反应（1）中得到的酶比反应（2）中得到的酶 高100倍
在水溶液中其活性 ： 相同
2 . 有机溶剂对酶活性的影响 有机溶剂的强弱可用极性系数lgP表示 （P 是指某种溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数） 极性系数越大，表明极性越弱； 反之极性系数越小，则极性越强。
酶活性与lgP的相关性： lgP≤2 极性溶剂中 酶活力较低
lgP为2～4
lgP＞4
中等极性溶剂中
非极性溶剂中
中等酶活力
• 立体选择系数KLD：表示对映体选择性的大小
Kcat / K m L K LD Kcat / K m D
• •
Km：米氏常数 Kcat：酶的转换数
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2.2 对映体选择性
• 立体选择系数越偏离 1，酶催化的对映体选择性越 强。
• 酶在水溶液中催化的对映体选择性较强，而在疏水 性强的有机介质中对映体选择性较差。
酶具有区分两个结构相似的不同底物的能力，取决 于底物疏水性能的差异。
N-乙酰-L-丝氨酸乙酯
ie. 胰凝乳蛋白酶
N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
疏水作用 水、辛烷
2. 酶在有机介质中的底物特异性与选择性
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2.2 对映体选择性
• 对映体选择性：酶在对称的外消旋化合物中识别 一种异构体的能力。也叫立体异构专一性。
是无毒、低粘度、产物易于分离。������
• 超临界流体的粘度介于气体与液体之间，其
扩散性比一般溶剂高1-2个数量级。超临界气 体在临界点附近的温度或压力有一点微小的 变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化， 因而很容易调控超临界流体中酶催化反应的 特性，如反应速率和选择性。
• ������
该体系的缺点是需要有能耐受几十个兆帕
超临界流体
• 超临界流体的概念
指温度和压力均在本身的临界点以上的高密
度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解
力；然而其扩散系数又接近于气体，是通
常液体的近百倍。
• 超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯
化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应
都可在此体系中进行，但研究得最多的是水
解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点

酶活最大时——蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性 （柔性）之间达到最佳平衡点。
酶分子的结构特点：
“刚性”
刚-柔并存
“韧性”
O
H
N
H
O
C
N
H
O
分子内氢键

分子间氢键
刚性：生物大分子结构的精确性 柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。
六、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1 . 有机溶剂对酶结构与功能的影响 1）对酶分子表面结构的影响 2）对酶活性中心结合位点的影响： 部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争 活性中心的结合位点，降低底物的结合能力，从 而影响催化能力
四、有机溶剂反应体系
1、有机溶剂与微量水组成的微水介质体系
2、水与亲水性有机溶剂组成的互溶体系
3、水与疏水性有机溶剂的双液相体系
不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含 有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
五、水对有机介质中酶催化反应的影响
1. 水对酶分子空间构象的影响
3. 扩展了酶的应用领域
多肽、酯类的合成，甾体转化，手性药物的拆分
二、酶非水相催化的主要内容
1. 有机介质中的酶催化 * 酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物或产物为疏水性物质的酶催化作用。 2.气相介质中的酶催化 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的 酶催化反应。 3.超临界介质中的酶催化 超临界流体是温度和压力超过某物质超临界点的流体。 4. 离子液介质中的酶催化 离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子 构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类。
第七章 酶非水相催化
Enzymatic Non-aqueous Catalysis, Enzyme Catalysis in Non-aqueous Phase
水是酶促反应最常用的反应介质。
但对于大多数有机化合物来说，水并不是一 种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物) 在水介质中难溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、 聚合和分解等副反应的发生。
由于在微水状态构象的刚性，而且缺 少在水中引起不可逆热失活的共价反应， 因此酶在微水的有机溶剂中具有非常好的 热稳定性。
某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性
酶 猪胰脂肪酶 酵母脂肪酶 脂蛋白脂肪酶 胰凝乳蛋白酶 介质条件 三丁酸甘油酯 水， pH7.0 三丁酸甘油酯/庚醇 水，pH7.0 甲苯，90℃，400 h 正辛烷，100℃ 水，pH 8.0, 55℃ 热稳定性 T1/2 < 26 h T1/2 < 2 min T1/2 =1.5 h T1/2 < 2 min 活力剩余40％ T1/2 = 80 min T1/2 = 15 min
＋
抑制剂 酶蛋白
冻干 除去抑制剂