发酵——菌种的来源共45页

二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
三、目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
遗传性能要相对稳定
不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）
生产特性要符合工艺要求
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等，表2-2 （P31） 但主要是通过培养的方法
定向培养的富集方法
1、底物
2、pH条件
3、培养时间
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高;
第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性 有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物
有些微生物能在极端的环境下生长
二：工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物
采样（造纸厂） →80度30分钟处理 ↓
0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
例：醛肟水解酶的筛选 --Journal of biotechnology 94(2019), 65-72
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
链霉菌
放线菌产生的主要抗生素 稀有放线菌
氨基糖苷类 氯霉素 链霉素 环丝氨酸 林可霉素 新生霉素
小单胞菌
氨基糖苷类 大环内酯类 肽类
游动放线菌
缩酚肽类 肽类 多烯类
诺卡氏菌
氨基糖苷类 氯霉素
链孢囊菌
氨基糖苷类
表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
五、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
2019,陈文新（科学院院士）
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
第三节 自然界中有目的微生物分离的原则
一、菌种分离的一般过程 土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 调节机制
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
三、食品酶制剂生产有关的微生物
优胜霉素
普拉克托霉 素
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
四、菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）
从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖
产生菌在适当的Βιβλιοθήκη Baidu养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
In contrast to this traditional approach, modern molecular biology
techniques allow for DNA library expression screening, which also