Wistar大鼠EAE模型的制备

Wistar大鼠EAE模型的制备

作者：刘颖刘华辛晋敏马太花梁丽云马存根摘要目的:检测EAE中起关键趋化作用的MCP-1的表达，探讨山西医科大学动物室的Wistar大鼠诱导实验性变态反应脑脊髓炎动物模型。方法:采用免疫诱导方法制备EAE模型并HE染色，同时用原位杂交法检测EAE 大鼠MCP-1的表达。结果:免疫后12d～17d，发病鼠出现EAE临床症状，HE染色，光镜下可见血管周炎性浸润，MCP-1的表达明显增加。结论:山西医科大学Wistar大鼠成功的诱导实验性变态反应脑脊髓模型是可信、可用的。

关键词完全抗原;Wistar大鼠;EAE;MCP-1

多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）是中枢神经系统（CentralNervous System，CNS）的炎性脱髓鞘疾病，多发于20岁～40岁女性，大多数患者的病程为复发和缓解交替，在复发期常出现视力受损、肢体无力、平衡失调、麻木、感觉异常、口齿不清、眩晕、大小便机能失调等症状。MS病因和发病机制复杂，一般认为与免疫、病毒感染、遗传等因素有关。实验性变态反应性脑脊髓炎（ExperimentalAu-toimmune Encephalomyelitis，EAE）的病理变化及发病机制与急性MS极其相似，因此，成功的建立EAE模型对MS的研究有很重要的意义。本实验的研究可为后期的研究工作提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料Wistar大鼠:购自山西医科大学动物实验室。原位杂交试剂盒:购于武汉博士德生物制品公司。

1.2 方法

1.2.1 完全抗原的制备:取液体石蜡40mL，羊毛脂20g混合、加热并融化制得不完全弗氏佐剂（In-complete Freund'sAdjuvant，IFA），分装入10mL小瓶，高压灭菌后4℃冰箱保存。健康350g～450g左右雌性豚鼠用3%戊巴比妥45mg/kg腹腔注射至四肢瘫软。无菌状态下，剪开胸腔、剥离心包，0.01mol/L PBS左心室灌注直至肝脏变白;迅速取其脑脊髓，小心剥离脑脊膜后称重，加入等量生理盐水，制成50%（W/V）匀浆。同时融化IFA，1mL IFA加入约10mg的M.bovisBCG即制得CFA。将CFA与GPSCH等体积混合，用注射器反复抽推，制成油包水乳液，制成完全抗原，放置冰上备用。

1.2.2 模型制备:将健康、雌性Wistar大鼠30只，随机分成正常对照组、佐剂组和EAE组，三组大鼠左后肢足垫皮下分别注射完全抗原0.4mL/只，百日咳原液0.05mL/只（含5.0×10 9 个菌体）。记免疫当日为零天，每天称重，采用双盲法两人进行临床症状评分，取平均值，临床评分2分为发病动物，临床评分采用通用的五分评分法，即:0分无症状，1分动物尾部肌张力降低，2分动物尾部麻痹+后肢肌张力低，3分尾麻痹+后肢肌张力重度低，4分尾麻痹+四肢麻痹，5分频死状态。发病动物只数/实验动物只数为发病率。免疫后12d～17d，3%戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射，至四肢瘫软，无菌状态下，剪开胸腔剥离心包，0.01mol/L PBS左心室灌注至肝脏变白;4%多聚甲醛灌流至尾部僵直，解剖迅速取其大脑视交叉前后2mm组织、小脑和脑桥部、脊髓颈腰膨大处，再用4%多聚甲醛固定半小时，做常规石蜡包埋、切

片。

1.2.2 HE染色:按常规方法进行。

1.2.3 ISH染色:参照试剂盒中的方法进行。

2 结果

2.1 EAE发病动物的临床评价EAE组的发病率为91.6%;临床症状评分为

3.46±1.45，最高临床症状评分达5级，毛色差，全身皆瘫，只有呼吸存在;EAE组的体重减轻可达（30.91±12.85）g。正常大鼠和佐剂组均没有发病，正常大鼠体重呈持续增加，而佐剂组体重几乎没有变化。EAE鼠在免疫后12d～17d发病产发病前毛色发暗，活动较少，食欲较差;发病时，临床评分随着时间延长加重，临床症状有多种形态，例如:单侧偏瘫、头向一侧瘫、视力明显下降类似与人的MS的多种情况;发病后，症状减轻，食欲开始增加，体重恢复等。 2.2 病理检测在临床症状出现之前，EAE大鼠和佐剂组、正常大鼠一样，CNS中几乎找不到典型的血管周炎性细胞的浸润，也找不到其他病理上的改变。当出现临床症状时，CNS内有典型的血管周炎性细胞的浸润。随着病情的增加，炎症病灶的范围和细胞浸润的程度也相应增加，临床症状评分为3级的典型EAE动物仅在腰膨大处发现EAE典型的血管周袖套样炎性细胞浸润;3级以上者，可在视交叉区域及大脑的皮质、皮髓交界处甚至深部髓质，脑脊膜和侧脑室周围都有大量的EAE 典型的血管周袖套样炎性细胞浸润;临床表现不一样的动物，血管周袖套样炎性细胞浸润的部位、程度、范围、数量也不一样。在缓解期间，临床症状减轻、消失的动物，CNS内典型的病理变化也相应减轻或消

失（图1）。

2.3 原位杂交结果正常大鼠和佐剂组的MCP-lmRNA阳性细胞数为4±2，EAE组为36±30，方差分析:F=15.81，P=0.0001<0.01，差异非常显著。q检验:EAE组MCP-1mRNA阳性细胞数与正常对照组、佐剂组分别比较均有统计学上的差异（P<0.01），正常大鼠与佐剂组之间没有统计学上的差异（P>0.05）（图1）。

图1 正常大鼠、EAE大鼠HE和ISH染色×400 略

3 讨论

EAE是自身免疫性疾病MS的理想动物模型，EAE模型的诱导与多个因素有关系，比如:①动物的类型、品系、年龄，性别;②所用的抗原纯度、类型、计量、物理形态和注射方法;③佐剂的来源等。通过总结其他人的实验方法，本实验摸索出一个针对山西医科大学Wustar 大鼠EAE实验模型的制作:动物发病率高，稳定，为本实验室的后期工作提供了一个非常宝贵的经验［1］。

EAE模型的发病机制与MS的类似:髓鞘蛋白反应性CD4+Thl活性增高，导致Thl细胞因子（尤其IFN-7是一种关键性的因素）上调;疾病的免疫细胞要经过趋化、粘附、生物膜的降减等作用才能进入CNS，在EAE或MS中，与这些活动有关的细胞因子MCP-1、ICAM-1MMPS等一般都上调;此外，NO可对神经元也起抑制性细胞毒作用。

其中MCP-1是β类趋化因子家族的一个成员，Godiska等曾发现:MCP-1表达广泛分布在脊髓［2］，在主动免疫的C57BL/6MCP-1-裸鼠会产生效应性T细胞，但没有出现EAE临床症状，将这些细胞转