微生物快速检测技术研究进展

微生物快速检测技术研究进展

董志珍　秦贞奎

(天津动植物检疫局　300457)

食品中的微生物是人类许多疾病发生的根源之一。近来,食物病原微生物导致的疾病随处可见,且平均每年发病1975万例(1),死亡4600人。这些疾病每年对食品生产及国家经济造成的损失约为5—814×104亿美元。以上数据无可辩驳地表明,在食品生产过程中需不断地对食品微生物进行快速、准确的检测和筛选。

近年来,快速微生物检测技术取得了显著的进展(2)。60、70年代初,临床微生物学家对此项技术进行了创新,形成了食品厂快速微生物检测试剂盒,80、90年代它又取得了关键性技术进步(3)。目前,在微电子学、微机技术、滤光技术、免疫及基因工程等领域的突破,犹如给本技术增添了燃料,使其发展更为猛烈和快速。

本文介绍一些新的快速微生物检测技术及仪器,从四个方面对各种技术进行简要的讨论并展望食品微生物检测技术的发展。

1　几种最新诊断技术和设备系统

111　疏水网格滤膜滤器(H G M F)　此网格滤膜可代替常规的平皿制作技术,它可使细菌在其上生长繁殖。一张膜含有1600个网格, H G M F具有除去抑制因子或不需要的营养素而集中微生物的特性,同时它还含有一个3—LO G计数范围仪(4)。其过程是将处理好的直径小于5微米的食物样品在网格滤器上过滤,这时靶微生物就可被网格捕获,将捕获微生物后的H G M F放于一合适琼脂上培养,经过一段时间后,则可进行菌落计数。

112　佩特里(PETR IF I LM)系统　本系统以可用水化的营养素代替培养基。使用者将1mL 液体样品放于膜系统的中央,水化的营养素可支持微生物的生长,经过一段时间的培养后,便可与常规培养皿一样而进行菌落计数。本系统可进行酵母、霉菌、大肠杆菌的计数,且大肠杆菌于培养后6小时即可出现特征性菌落。

113　免疫磁珠　本技术可免除增菌培养步骤。将样品与靶微生物抗体覆盖的磁珠相混合,这样,靶微生物便可从样品材料及磁性区域内的其它微生物中分离出来。而后将磁珠放于培养基上过夜,第二天,将平皿上之菌落转移至用抗靶抗体物质处理过的塑料膜上,抗抗体与靶抗体结合而出现有颜色的斑点。这些斑点与主平板上的靶菌落是相对应的。在一些李氏杆菌污染的样品中,免疫磁珠的检出率为100%,而常规方法检出率则为36%。

2　免疫学技术

免疫学技术依赖于抗体的形成。单克隆抗体直接针对病原菌特异性抗原部分或它们的毒性部分。因而,其发展导致各种的免疫学技术应用于食品微生物领域(5)。

酶免疫分析试验(E I A)　本试验分为同源性及异源性两类。用于食品微生物检测的是异源性分析。这些试验有许多步骤,且在每两步间需要冲洗以除掉未结合的部分。本分析需要酶标记(如葡萄糖化酶)来催化反应而使无颜色的底物降解成有颜色的产物。这些产物可用肉眼观察或用分光光度计测量。

“三明治”(因为抗原被包被于两抗体分子间)酶联免疫吸附试验(EL ISA)是最广泛应用的一种。在非竞争EL ISA中,两类抗体均过量,这两类抗体有相同的特性或它们可以与病原体的不同部位结合。将样品与包被了靶抗体的固相混合时,其中的微生物便会结合于固相表面。冲洗固相后加入标记抗体。抗原抗体反应而发

21天津畜牧兽医

生颜色变化,此变化直接与抗原的数量有关。此试验结果是通过肉眼观察或用微量读板仪读记。它可用于检测沙门氏菌、李氏杆菌、葡萄球菌肠毒素和大肠杆菌O—157,其中沙门氏菌检测试验已由美国公职分析化学家协会(AOA C)批准用于所有食物的检测。

3　发光

发光化学反应及生物性反应与各种各样的免疫分析及DNA探针技术相结合而形成了几种快速微生物检测技术的基础(6)。

由于所有生物性材料含有磷酸核苷A T P 的浓度是恒定的,因而试验是通过生物中A T P 的含量来计数病原体。尽管此方法只在某种特定条件下是有效的,但它却是目前计数病原体最快的方法。

在食物样品中,细菌的重量占不到百分之一,因此,样品中A T P浓度由于其它无关因素的影响而变得很少。由于这个原因,使用A T P 生物发光来检测细菌数量依赖于有效地从食物中分离纯化细菌。A T P生物发光可用于提示粗制品的污染状况,即可快速、简便地监测环境卫生及净化操作步骤。

311　生物发光　本系统由轻便的可读发光表和数据存贮单位及包有试剂的实验拭子组成。使用者擦拭食品加工设备及工作区,通过将拭子放在试剂柄中而使拭子具有了活性而释放试剂,然后,将样品插入发光计而读数。若用于监测操作的环境卫生,则读数将提示污染的状况。312　化学发光　是化学反应的结果。通过使用发光的化学物质,如苯巴比妥及其衍生物异苯巴比妥来确定分析物的浓度。

4　DNA RNA探针

DNA探针是一较短的被标记的脱氧核糖核酸序列,它可与从微生物中抽提出的DNA 序列杂交或互补配对。它们以A—T,C—G的方式配对而形成双股DNA。若DNA探针之基础序列与靶微生物之特异性序列互补,则探针只与靶微生物之DNA相结合(7)。

本分析系统以同位素标记之DNA、RNA 探针来检测样品培养物中之微生物,每毫升增菌肉汤中其检测敏感性为106个微生物。此试验从分析的开始起于46～53小时出结果,它可用于检测沙门氏菌、李氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌等。

5　展望

PCR技术被誉为是分子生物学领域中又一项革命,在PCR中热稳定的DNA聚合酶可使短链的双股靶DNA快地复制成千上万倍。这样可使DNA数量急剧增长而达到检测极限。此技术可比细菌更快地增殖靶DNA,且其操作简单、快速、特异性强,因而其应用越来越广泛。

核糖定型　此系统从分离细菌菌落开始,分析的同时产生一有特色的模型,此模型由计算机分析且保存,此过程首先是从细胞中抽提DNA,而后由限制性内切酶将DNA分成片段,将这些DNA片段通过电泳分离后转移至膜上,通过与DNA探针杂交后,杂交片段发出的光就可由相机捕捉到。此图像可与数据库中的其它图像比较而确定是何种病原体。此种鉴定技术可准确鉴定且可在种间区别微生物,本技术在食品加工过程中可准确定位污染的种类。

最近,又出现了一些更新的分子生物学技术,如质粒DNA分析、基因组DNA微量限制分析及常量限制分析和基于亚型鉴定的聚合酶链反应(8),这些方法也将逐渐用于食品微生物的检测中。

参考文献

1　IFT1Food T echno l,1995,49(4):119-131

2　D ziezak,J.D.Food T echno l,1987,41(7):54-73

3　Fung,D,Y,C11995b.R ap id m ethods and autom ati on in food m icrobi o logy p.3-22.V CH publishere,inc.,N ew Yo rk

4　Sharp,A.H.Food A ustralia.,1993,45(3):129-134

5　H um bert,F.and L ahellec,C.,P.1092119V CH publishers, inc.,N ew Yo rk

6　K ricka,L.J.C lin.Chem.,1991,37(9):147221481

7　F lint,S.H.et al:Food T echno logists.,1994,24(3):26229 8　Sw am inathan,B.Food T echno logists,1995,June,327

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1996年第13卷第3期(总第51期)