荧光标记染料

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

荧光标记染料
杨祥宇 宋 健 冯荣秀3
(天津大学药物科学与技术学院 天津 300072)
摘 要 荧光标记染料在生命科学领域具有极大的应用前景,基因芯片的研究开发使荧光染料应用于药理研究、药物毒性、药物靶标研究、医学诊断等领域。

本文对荧光素、若丹明、菁染料等核酸及蛋白质分析检测用荧光标记染料的结构、性能及其应用特点作了较为详细的介绍。

关键词 荧光 标记 染料
Advancement of Study in the Fluorescent Label Dyes
Y ang X iangyu,S ong Jian,Feng R ongxiu3
(C ollege of Pharmaleuticals&Biotechnology,T ianjin University,T ianjin300072,China)
Abstract Fluorescent Dyes applied as functional dyes are gradully extending their application fields.Especially, they are widely used in the field of labeling in the biologic macrom olecules,pharmacology,drug2induced cytotoxicity assays,drug target design,clinical diagnoses and s o on.This paper presents the serious,structure,properties and appli2 cations of fluorescein,rhodamine,cyanine dyes and other fluorescent dyes.
K ey w ords Fluorescent dye,Fluorescent probe,Cyanine dye
染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色,然后对切片进行观察。

随着生命科学的不断发展,以及计算机技术、激光技术、荧光光谱测定技术的不断进步,许多染料尤其是荧光染料在DNA测序[1]、细胞检测[2~4]、毒物分析[3]、临床医疗诊断[3]等方面得到了广泛的应用。

因此研究开发新的具有低背景、良好的光稳定性且光量子产率高的荧光染料,将会有利促进生物技术发展。


1 荧光标记染料的结构及性能
111 蛋白质分析用荧光染料
11111 荧光素类染料[3~6] 上世纪80年代初期,流式细胞仪和单体克隆技术广泛应用时,最常用的荧光标记物就是荧光素,它是生物技术中最常用的标记染料之一。

荧光素类的主体结构如1和2所示。

其中2为由主体结构1所形成的内酯形式。

在荧光素类染料结构中,因苯环上含有较大的羧基,使芳环保持在近乎垂直于 吨生色团的位置,没有活动性,使荧光量子产率提高。

此类荧光染料的光稳定性好,但其Stork位移小。

杨祥宇 男,28岁,硕士生,现从事药物化学及精细化工中间体研究。

 3联系人
2002209220收稿,2003205206修回
主要包括以下基团:
3
这些基团易与被标记分子中的NH
2、OH、SH等结合,如异硫氰荧光黄或荧光异硫氰酸酯(FIT C,R
=R2=H,R3=—NCS)中的—NCS易与蛋白质中的NH2结合,使其应用于蛋白1
质分析。

荧光素在488nm处由氩离子激光激发,发射光接近525nm的绿光,通常用于流式细胞仪和共焦
显微镜。

荧光素二乙酸酯(FDA)为荧光素的非荧光酯,它的E
xΠE m为489Π514nm,它是常用的底物,它可产生缓慢渗透的荧光素,早期应用于染料排外性能测试中性能优越。

但它在细胞内水解为荧光素,在活细胞中荧光消失相对较快,因此,现在它很少用于细胞生存能力指示剂。

11112 若丹明类染料[4~6] 若丹明类染料是生物技术中常用的蛋白质分析染料之一。

其主要结
构如下:
其结构中的R
2、R3为活性基团,活性基团主要为—NCS、—S O2X(X=F、Cl)等,其中磺酰氟比磺
酰氯有更强的反应活性。

活性基团的主要结合基团为蛋白质中的—NH
2。

染料中的二烷氨基的活动性随温度的升高而增强,因此消耗在激发态振动能级之间转换的能量将随温度的升高而增加,其结果会降低光量子产率。

而刚性的若丹明101(5,R
=—S O3,R3=—S O2Cl)等的量子产率接近
2
100%。

由于最早的流式细胞仪采用荧光素为染料,使用的激发光源为488nm氩离子激光,而若丹明类在该波长处不激发。

如果将若丹明染料用于流式细胞仪中,则需要第二个激发光源,这将使流式细
胞仪相对很昂贵。

若丹明类染料多用于显微镜分析中免疫荧光分析。

11113 二苯乙烯荧光染料[5,6] 二苯乙烯荧光染料6在染料工业上是荧光增白剂的重要产品,含
有—NCS 的二苯乙烯荧光染料用于对神经细胞膜进行染色。

R 1
SO 3Na
R 2SO 3Na
R 1=—NCS R 2=—NCS 或—NHC OCH 3
611114 萘酰亚胺荧光染料[5~7] 1,82萘二甲酰亚胺7是一类良好的荧光发色体,其42NH 2等供电子基团的衍生物大都具有强烈的荧光。

含酰肼和乙烯砜活性基团的活性萘酰亚胺染料,在适当的pH 和温度下,对微生物着色有专一选择性。

由于其无毒,可用于活细胞的细胞内染色。

LiO 3S
N O R
O
NH 2
SO 3Li or
R =NHCONHNH 2
R =SO 2CH CH 27 11115 香豆素型高分子荧光染料[5,8] 以香豆素为母体的荧光染料,如果染料中含有—NH 2、
—C OOH 等基团
,在一定条件下也可与被标记物发生反应,而含有Hg +基团的荧光染料可选择性地
与蛋白质中的—SH 发生反应。

用聚合物上连有大量荧光团的高分子荧光染料进行标记,其灵敏程度大大提高,它在量子产率、Storke 位移、光稳定性、分子均匀性、与蛋白质配对的产率及对生物活性的干扰等方面均满足要求。

11116 其它蛋白质分析用染料[5
] 吖啶类染料8、芘类染料9、苯并呋喃类染料10等也是蛋白质分析用荧光染料。

112 核酸分析用荧光染料
11211 菲锭类荧光染料[3,4,6,9,10] 溴化乙锭E B 11和磺化丙锭PI 12是核酸分析中常用的标记物。

其结构中均含有菲锭环,两者均能与DNA 或RNA 结合,且结合物荧光增强。

溴化乙锭是早期用流式细胞仪检测细胞生存能力时最常用的指示剂,但其分子中仅有一个正电荷,其N2烷基基团是乙基,在pH高时它能缓慢进入活细胞,此时为膜渗透性染料,它既可渗透原核细胞膜,也可渗透真核细胞膜。

现在已用碘化丙锭取代E B作为流式细胞仪中细胞生存能力指示剂。

PI的水溶性比E B好,但膜透过性比E B差。

由于PI的N2烷基基团处以一个丙基形成季铵盐,使其具有两个正电荷,可以阻止它进入完整的细胞膜,因此PI是一种膜不可渗透性染料。

PI与DNA、RNA复合时可在488nm处激发,显现出很亮的信号。

但这种复合过程是可逆的,因此,必须在分析过程中保持细胞外介质不变。

乙锭同型二聚体(E thD21,E thD22等)每个分子具有四个正电荷,其光谱特性与碘化丙锭相似,但它们对核酸具有更高的亲和力,使用的实际浓度可以低些。

资料显示,E thD22对DNA的亲和力较高,适合于各类细胞中死细胞的染色。

乙锭单叠氮化合物(E MA)具有一个正电荷,它可进入破碎的细胞膜,并在可见光照射时即可与核酸共价结合。

它主要用于确定细胞在固定之前是否为死细胞。

11212 双苯并咪唑及与其搭配使用的荧光染料[4,6] H oechest3325813和H oechest33342
并咪唑类荧光染料。

其中H oechest33258可与纳克级的DNA特异性结合,几乎没有RNA亲和性。

它与DNA结合后自身的荧光量子效率提高400倍。

其中AΠT(腺嘌呤Π胸腺嘧啶)含量高的DNA对荧光增强最显著,GΠC(鸟嘌呤Π胞嘧啶)含量高的DNA以及单链DNA对它的荧光增强依次减弱。

11213 4,62二氨基222苯基吲哚[4,6,11] 4,62二氨基222苯基吲哚14的使用特性与H oechest双苯并咪唑染料相似,在紫外激发,最大幅射波长在蓝色光谱区的450~500nm之间。

当其与一个DNA中的A2T结合时,荧光增加约100倍。

11214 色霉素A3和光神霉素[4] 色霉素A3和光神霉素分别与G2C碱基对
结合时其荧光增强。

它们可被紫光或蓝紫光激发,辐射525~550nm绿色光。

H oechest33258和色霉素A3已被用于双光束激光流式细胞仪中,以识别基于
DNA碱基对组成不同的大多数的人类染色体,同时也可用于研究细菌种类
之间的碱基组成的不同。

11215 哌洛宁[4] 哌洛宁(pyronin Y,C17H19ClN2O)可对哺乳动物细胞核糖体RNA进行专一性染色或标记。

它受蓝绿色或绿色光激发,辐射575nm左右黄色光。

采用荧光标记核酸代替放射性标记,可以避免使用价格昂贵的放射性试剂以及在运输、保存和使用中对人体的危害。

H oechest与哌洛宁、甲基绿与哌洛宁混合染料可用来标记RNA。

H oechest及甲基绿与DNA结合可阻止DNA与哌洛宁结合。

11216 海藻类蛋白[4] 1982年报道海藻的藻胆蛋白可用作很有效的荧光标记物,它的Stork位移较大。

藻红蛋白与其它染料连接在一起后最大发射谱为较长的微波。

藻红蛋白与免疫球蛋白G 抗体结合后,使其分子量增加约150%,因此它们可以用于细胞表面结构着色,来标记抗体或血凝素。

但由于分子量大,它们不能用作显示细胞内组成的标记试剂。

11217 菁染料 菁染料通常由两个杂环体系及中间的次甲川链组成,其核心结构[12]如15所示。

其中X 可以是O 、S 、Se 或NR 、CR ,t =1~4,Y m 、Y p 为
R 3R 4,m 、p 为0或1,m +p =1,R 为1~6个碳原子的烷基,可为链状或环状。

Ψ-为Cl -、Br -、I -等负离子。

当X 为O 时,第一杂环体系
为苯并 唑;当X 为S 时,第一杂环体系为苯并噻唑;此两种结构优于其它结构,其中最优结构为苯并噻唑。

研究菁染料合成及其性能的文献很多[13~18]。

Lee 等
[19]1990年合成了含有苯并噻唑环和嘌呤环的菁染料,用于对RNA 进行染色。

Wenceslao 等
[20]1997年合成了第一个杂环为苯并噻唑、 唑、硒唑、咪唑系列,第二杂环为嘌呤环系的菁染料16,并研究了其荧光特性,研究结果表明平面刚性
结构强的染料发射荧光强度大。

应用较多的菁染料有Y OY O 系列、Y O 2PRO 系列、T OPRO 系列、T OT O 系列、BOBO 系列、T OT AB 系列、SY T O 系列、PicoG reen 、SytoxG reen 等[8,21~27]。

其中典型化合物有T OT O 17和Y OY O 18。

这些染料当与双链核酸结合时(包括DNA 和RNA ),其荧光增强。

它们可以用来对细胞内核酸进行标记。

当专门用于标记DNA 时,必须先加入RNA 酶进行处理,菁染料也可与寡聚核苷酸探针同时使用,以显示和定量分析细胞中的特定核酸序列。

1995年Skeidsv oll 等[27]通过采用激光诱导的荧光检测器毛细管电泳的方法检测dsD N A ,分别使用了SY BR G reen I 、Y O 2PR O 21和T O 作为荧光染料。

研究结果表明:Y O 2PR O 21和T O 在dsD N A 检测中均为很有用的荧光染料;SY BR G reen Ⅰ是目前最灵敏的dsD N A 荧光染料,可通过488nm 氩离子激光激发,染料具有极低的荧光,但当其与dsD N A 结合后染料dsD N A 复合物荧光大大增强,且检测线性范围广,受背景干扰小。

SY BR G reen Ⅰ最适合于采用上述方法对dsD N A 进行有效分离和定量检测。

2 荧光标记染料的应用
211 荧光标记染料最早对微生物细胞染色的应用[4]
采用显微镜可对微生物大小、外形及流动性等特性进行观察,但当一些与微生物大小相近的无
机或有机颗粒与其共存时,无法用显微镜将两者区分开,因此无法准确表达微生物特性。

此时可采用标记染料与微生物进行特异性结合,从颗粒中识别出微生物。

212 用流式细胞仪对细胞生存能力的检验及其实际应用[3,4]
流式细胞仪可对多个参数进行分析,在此项技术的应用中,采用了荧光标记染料对微生物细胞进行标记。

荧光染料与核酸、蛋白质等大分子吸附或共价结合后,其荧光特性发生变化,从而反应有关大分子性能的信息。

21211 确定细胞是否生存的方法 确定细胞是否生存一般有两种方法:(1)通过检测细胞对一些染料如trypan blue或碘化丙锭的排外能力来确定。

一般认为细胞生存时,细胞膜完整即细胞膜功能正常,上述染料不能渗透到细胞膜内,因此不能与细胞内核酸结合,则其荧光特性不会变化;而细胞死亡后,细胞膜不能阻止荧光标记染料与核酸结合,通过采用流式细胞仪检测荧光特性的变化,可确定细胞生存状态。

(2)通过将荧光标记染料与细胞在基质中培养,其后测量细胞膜电势来确定细胞的代谢活性。

细胞膜内外存在电位梯度,相对外部来说,内部为电负性,细菌细胞膜两侧通常维持大于100mV的电位梯度。

带电荷的染料容易穿过细胞膜的双脂层部分,但它们将对电位梯度有不同的反应。

正电性的亲脂性染料,如若丹明123和菁染料,按膜电势将会浓集到细胞内部;而负电性的亲脂性染料,如ox onols将被细胞膜排除在外。

采用流式细胞仪可测量染料进入细胞的数量,另外通过测量细胞膜的性质如膜电势或反膜电势的存在,可确定其生存状态。

21212 确定细胞生存能力的实际应用 通过确定细胞生存能力,可以评价细胞对于生存环境、化学药物及冷冻、解冻等的反应,对实际应用有重要意义,在化工产品毒性监测、临床医学研究、免疫表征、药物开发等领域中得到了重要应用。

(1)化工产品毒性监测:清洁剂、低渗溶液、细胞毒性肽,如蜂毒肽或pilosulin1等,可以使细胞膜受到严重破坏,甚至使细胞死亡。

如果细胞生存环境遇到上述情况,对于其生存能力或是否生存的检验就可以采用特定的荧光染料,如前面所提到的碘化丙锭等来检验。

若细胞生存即细胞膜完整时,则细胞排外性染料如碘化丙锭必定被排除在膜外,否则染料会渗入到细胞内部与核酸结合,通过检测染料荧光特性变化,可以检测出受损细胞量。

细菌细胞膜结构、病毒细胞膜结构与哺乳动物细胞膜结构不同,细胞膜对不同染料的渗透特性不同。

当评价清洁剂及杀菌类产品性能时,既要评价它们对于细菌细胞的杀灭性能,也要考虑产品尽量减小对人或哺乳动物细胞的破坏能力。

其评价过程是将被检产品与不同种类的细胞一起培养,随后采用不同渗透特性的荧光染料进行标记测试,确定各种细胞的生存状态。

荧光染料的应用可使化工产品的毒性检测方便快捷。

(2)药物研究开发:药物诱导细胞毒性是抗癌药物的重要特性,评价药物对肿瘤细胞的杀伤力对于评价抗癌药物的性能至关重要。

在采用药物处理细胞系的过程中,可使用核酸荧光染料与荧光素二乙酸酯(FDA)一起来确定细胞膜的完整性,间隔一段时间用流式细胞仪检测生存细胞的数量,确定药效。

(3)临床医学应用:人体外围组织移植过程中,通过检验C D干细胞的存活情况来评价移植优势。

通过测定经过冷冻Π解冻后脐血中C D34干细胞的死亡率,可确定血液的保存方式,提高移植效率。


在临床免疫表征研究中,用荧光抗体进行免疫表征时,需要鉴别并排除死亡或将死亡的细胞的影响,因为它们会与抗体非特异性结合,从而改变细胞表面抗原的表达。

213 荧光染料用于基因芯片
最初的生物芯片主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达谱鉴定和基因突变体的检测和分析,所以它被称为DNA芯片或基因芯片。

荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的一种报告标志,以激光为激发光源的共聚焦扫描装置可对进行芯片杂交结果进行检测。

用于分子信标的荧光染料荧光素类主要有62羧荧黄、Oreg on G reen500、Oreg on G reen514、四碘荧黄等,若丹明类有62羧若丹明、若丹明红2X、四甲基若丹明等,菁染料常用的有吲哚232菁、吲哚252菁、吲哚25152菁等,芘、香豆素类、甲氨喋二酮等均用于基因芯片分子信标。

3 展望
在生物技术研究领域中,利用荧光染料进行标记分析,其要求是操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性等特点。

从最早流式细胞仪中使用的荧光素、若丹明、溴化乙锭,到后来研究较多的H oechest双苯并咪唑及两种荧光染料的联合应用。

最新的主要是由分子探针公司开发的各种系列的菁染料,从这一趋势可以看出,菁染料系列将在将来荧光染料领域中以优异的性能替代部分其它染料,在将来荧光标记分析起重要作用。

参考文献
[1] V D olnik.J.Biochem.Biophys.M ethods,1999,41:103~119.
[2] A Rudolf,L W olfgang.FE MS M icrobiology Reviews,2000,24:555~565.
[3] M A K ing.Journal of Immunological M ethods,2000,243:155~166.
[4] H M Shapiro.Journal of M icrobiological M ethods,2000,42:3~16.
[5] 匡春香,权春善,范圣第.染料工业,1997,34(2):16~20.
[6] 吕荣文,张淑芬,杨锦宗.染料工业,1999,36(6):14~17.
[7] 梅文明.中山大学研究生学刊(自然科学、医学版),2002,23(1):45~52.
[8] 朱爱平,吴世康.物理化学学报,1998,14(6):552~556.
[9] J Skeidsv oll,U P M agne.Analytical Biochem istry,1995,231:359~365.
[10] H S Rye,M A Quesada,K Peck et al.Nucleic Acids Research,1990,19(2):327~333.
[11] 陈鸿琪.化学研究与应用,2000,12(2):164~168.
[12] V S inger,X KJin,S Y P:5,658,751,1997.
[13] S M Y arm oluk,D B K ryv orotenko,V B K ovalska.Dyes and Pigments,2001,48:165~172.
[14] S T Y ue,L D Johns on,Z Huang et P:5,321,130,1994.
[15] R P Haugland,S T Y ue,P J M illurd et P:5,436,134,1995.
[16] B L R oth,P J M illard,S T Y ue et P:5,445,946,1995.
[17] L GLee,P A P:5,658,735,1997.
[18] T G Deligeorgiev,D A Z aneva,H E K aterinopoulos et al.Dyes and Pigments.1999,41:49~54.
[19] L G lee,M V Calif,P D M ize et P:4,937,198,1990.
[20] M W enceslao,A R F orrester.T etrahedron,1997,53(37):12595~12604.
[21] S C Bens on,P S ingh,A N G lazer.Nucleic Acids Research,1993,21(24):5727~5735.
[22] H S Rye,J M Dabora,M A Quesada et al.Analytical Biochem istry,1993,208:144~150.
[23] L N Thomas,K Nafisi,M Zhao et al.J.Phys.Chem.,1995,99:17936~17947.
[24] J P Jacobsen,B Pedersen,L F Hansen et al.Nucleic Acids Research,1995,23(5):753~760.
[25] G Sergio,K S W ells,I D Johns on et al.Analytical Biochem istry,1997,249:44~53.
[26] Z Z eng,S M Clark,R A M athies et al.Analytical Biochem istry,1997,252:110~114.
[27] J Skeidsv oll,P M Ueland.Analytical Biochem istry,1995,231:359~365.。

相关文档
最新文档