荧光标记染料

荧光标记染料

杨祥宇　宋　健　冯荣秀3

(天津大学药物科学与技术学院　天津　300072)

摘　要　荧光标记染料在生命科学领域具有极大的应用前景,基因芯片的研究开发使荧光染料应用于药理研究、药物毒性、药物靶标研究、医学诊断等领域。本文对荧光素、若丹明、菁染料等核酸及蛋白质分析检测用荧光标记染料的结构、性能及其应用特点作了较为详细的介绍。

关键词　荧光　标记　染料

Advancement of Study in the Fluorescent Label Dyes

Y ang X iangyu,S ong Jian,Feng R ongxiu3

(C ollege of Pharmaleuticals&Biotechnology,T ianjin University,T ianjin300072,China)

Abstract　Fluorescent Dyes applied as functional dyes are gradully extending their application fields.Especially, they are widely used in the field of labeling in the biologic macrom olecules,pharmacology,drug2induced cytotoxicity assays,drug target design,clinical diagnoses and s o on.This paper presents the serious,structure,properties and appli2 cations of fluorescein,rhodamine,cyanine dyes and other fluorescent dyes.

K ey w ords　Fluorescent dye,Fluorescent probe,Cyanine dye

染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色,然后对切片进行观察。随着生命科学的不断发展,以及计算机技术、激光技术、荧光光谱测定技术的不断进步,许多染料尤其是荧光染料在DNA测序[1]、细胞检测[2～4]、毒物分析[3]、临床医疗诊断[3]等方面得到了广泛的应用。因此研究开发新的具有低背景、良好的光稳定性且光量子产率高的荧光染料,将会有利促进生物技术发展。

1　荧光标记染料的结构及性能

111　蛋白质分析用荧光染料

11111　荧光素类染料[3～6]　上世纪80年代初期,流式细胞仪和单体克隆技术广泛应用时,最常用的荧光标记物就是荧光素,它是生物技术中最常用的标记染料之一。荧光素类的主体结构如1和2所示。其中2为由主体结构1所形成的内酯形式。在荧光素类染料结构中,因苯环上含有较大的羧基,使芳环保持在近乎垂直于　吨生色团的位置,没有活动性,使荧光量子产率提高。此类荧光染料的光稳定性好,但其Stork位移小。

杨祥宇　男,28岁,硕士生,现从事药物化学及精细化工中间体研究。　3联系人

2002209220收稿,2003205206修回

主要包括以下基团:

3

这些基团易与被标记分子中的NH

2、OH、SH等结合,如异硫氰荧光黄或荧光异硫氰酸酯(FIT C,R

=R2=H,R3=—NCS)中的—NCS易与蛋白质中的NH2结合,使其应用于蛋白1

质分析。

荧光素在488nm处由氩离子激光激发,发射光接近525nm的绿光,通常用于流式细胞仪和共焦

显微镜。荧光素二乙酸酯(FDA)为荧光素的非荧光酯,它的E

xΠE m为489Π514nm,它是常用的底物,它可产生缓慢渗透的荧光素,早期应用于染料排外性能测试中性能优越。但它在细胞内水解为荧光素,在活细胞中荧光消失相对较快,因此,现在它很少用于细胞生存能力指示剂。

11112　若丹明类染料[4～6]　若丹明类染料是生物技术中常用的蛋白质分析染料之一。其主要结

构如下:

其结构中的R

2、R3为活性基团,活性基团主要为—NCS、—S O2X(X=F、Cl)等,其中磺酰氟比磺

酰氯有更强的反应活性。活性基团的主要结合基团为蛋白质中的—NH

2。染料中的二烷氨基的活动性随温度的升高而增强,因此消耗在激发态振动能级之间转换的能量将随温度的升高而增加,其结果会降低光量子产率。而刚性的若丹明101(5,R

=—S O3,R3=—S O2Cl)等的量子产率接近

2

100%。

由于最早的流式细胞仪采用荧光素为染料,使用的激发光源为488nm氩离子激光,而若丹明类在该波长处不激发。如果将若丹明染料用于流式细胞仪中,则需要第二个激发光源,这将使流式细

胞仪相对很昂贵。若丹明类染料多用于显微镜分析中免疫荧光分析。

11113　二苯乙烯荧光染料[5,6]　二苯乙烯荧光染料6在染料工业上是荧光增白剂的重要产品,含

有—NCS 的二苯乙烯荧光染料用于对神经细胞膜进行染色。

R 1

SO 3Na

R 2SO 3Na

R 1=—NCS R 2=—NCS 或—NHC OCH 3

611114　萘酰亚胺荧光染料[5～7]　1,82萘二甲酰亚胺7是一类良好的荧光发色体,其42NH 2等供电子基团的衍生物大都具有强烈的荧光。含酰肼和乙烯砜活性基团的活性萘酰亚胺染料,在适当的pH 和温度下,对微生物着色有专一选择性。由于其无毒,可用于活细胞的细胞内染色。LiO 3S

N O R

O

NH 2

SO 3Li or

R =NHCONHNH 2

R =SO 2CH CH 27 11115　香豆素型高分子荧光染料[5,8]　以香豆素为母体的荧光染料,如果染料中含有—NH 2、

—C OOH 等基团

,在一定条件下也可与被标记物发生反应,而含有Hg +基团的荧光染料可选择性地

与蛋白质中的—SH 发生反应。用聚合物上连有大量荧光团的高分子荧光染料进行标记,其灵敏程度大大提高,它在量子产率、Storke 位移、光稳定性、分子均匀性、与蛋白质配对的产率及对生物活性的干扰等方面均满足要求。

11116　其它蛋白质分析用染料[5

]　吖啶类染料8、芘类染料9、苯并呋喃类染料10等也是蛋白质分析用荧光染料。

112　核酸分析用荧光染料

11211　菲锭类荧光染料[3,4,6,9,10]　溴化乙锭E B 11和磺化丙锭PI 12是核酸分析中常用的标记物。其结构中均含有菲锭环,两者均能与DNA 或RNA 结合,且结合物荧光增强。